海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染沉默AP4M1基因的慢病毒后AMPA受體的表達(dá)變化.pdf

1、目的
　　原代培養(yǎng)胎鼠海馬神經(jīng)元，并轉(zhuǎn)染包裝了沉默銜接蛋白復(fù)合物-4μ亞基（adaptor-related protein complex4, mu1 subunit；AP4M1）基因的慢病毒后，觀察細(xì)胞 AP4M1、GluR1及 GluR2（AMPA受體）的表達(dá)變化，以探究 AP4M1可能介導(dǎo)的AMPA受體運(yùn)輸變化的分子機(jī)制。
　　材料及方法
　　本課題將原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，應(yīng)用免疫熒光來標(biāo)記神經(jīng)元特異性烯

2、醇化酶（neuron-specifice nolase,NSE），來鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞中神經(jīng)元的純度。細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行慢病毒（沉默 AP4M1基因）轉(zhuǎn)染，并進(jìn)行熒光檢測(cè)，以鑒定轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)分組：陰性慢病毒轉(zhuǎn)染組及陽性慢病毒轉(zhuǎn)染組（AP4M1基因表達(dá)沉默）。
　　分別應(yīng)用 Real-time PCR和 Western blotting方法研究 AP4M1、GluR1及GluR2的mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化。
　　結(jié)果
　　

3、1、海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)、鑒定及轉(zhuǎn)染
　　原代培養(yǎng)的 SD大鼠胎鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，在種植后第7天神經(jīng)元基本發(fā)育成熟，神經(jīng)元免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示所培養(yǎng)細(xì)胞中的神經(jīng)元純度大于95％。在培養(yǎng)第2天可行慢病毒的轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染8-12小時(shí)后換液，并于72小時(shí)后重復(fù)轉(zhuǎn)染1次，再轉(zhuǎn)染8-12h，72小時(shí)后進(jìn)行熒光檢測(cè)，轉(zhuǎn)染率大于85%。
　　2、海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染慢病毒后AP4M1、GluR1及GluR2的表達(dá)變化
　　1）Rea

4、l-time PCR檢測(cè)：陽性病毒組 AP4M1 mRNA表達(dá)量較陰性病毒組顯著下調(diào)（t=68.193，P<0.01，n=8）；轉(zhuǎn)染后 GluR1、GluR2 mRNA表達(dá)量較陰性病毒組也明顯下降（t=8.060，P<0.01，n=8）；（t=8.154，P<0.01，n=8）。
　　2）Western blot檢測(cè)：轉(zhuǎn)染陽性病毒后AP4M1、GluR1及GluR2蛋白表達(dá)量較陰性病毒組顯著下調(diào)（F=7.566，t′=15.966