慢病毒載體介導(dǎo)siRNA沉默PTPσ基因促進(jìn)大腦皮層神經(jīng)元軸突再生及脊髓損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本課題篩選獲得高沉默效率的酪氨酸磷酸酶sigma(Protein Tyrosine Phosphatase sigma，PTPσ)特異性小干擾RNA（small interference RNA，siRNA），應(yīng)用第三代慢病毒載體系統(tǒng)將其導(dǎo)入原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元及脊髓損傷局部，阻斷硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)受體PTPσ的表達(dá)，消除CSPGs

2、對(duì)軸突再生的抑制作用，觀察PTPσ基因沉默對(duì)神經(jīng)元軸突再生及脊髓損傷后神經(jīng)功能的修復(fù)效果。
　　方法：
　　1.siRNA在線設(shè)計(jì)工具siRNA Wizard設(shè)計(jì)5條針對(duì)PTPσ基因編碼序列(coding sequence，CDS)的siRNA，通過(guò)雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）報(bào)告系統(tǒng)初步檢測(cè)其抑制效率。選取最高抑制效率siRNA，構(gòu)建第三代慢

3、病毒載體，并用其將高抑制活性siRNA導(dǎo)入原代培養(yǎng)神經(jīng)元及脊髓損傷局部，qRT-PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)PTPσ基因沉默的精確效率。
　　2.Wistar大鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)，并將其接種于包被多聚賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)、CSPGs及層粘連蛋白（laminin，LN）的玻片，高抑制活性PTPσ特異性siRNA慢病毒載體感染神經(jīng)元，感染后4天免疫細(xì)胞化學(xué)染色標(biāo)記神經(jīng)元軸突及CSPGs，并利用

4、Image-Pro Plus6.0軟件測(cè)量神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度、數(shù)量及穿越CSPGs的百分比，探索PTPσ沉默神經(jīng)元在CSPGs基質(zhì)上的再生及穿越能力。
　　3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用10周齡雌性Wistar大鼠，利用NYU Impactor Model-Ⅱ打擊器制備脊髓胸10(T10)損傷模型。隨機(jī)分為四組:對(duì)照組(DMEM)、PTPσ-control組、PTPσ-scrambled(PTPσ-scr)組、PTPσ-RNAi組，造模后立即行各組

5、相應(yīng)的局部注射。局部注射后1d、1w、2w、3w、4w、5w、6w行大鼠后肢功能行為學(xué)評(píng)分(BBB評(píng)分)，并于6w行大鼠腳印學(xué)分析，以觀察大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。局部注射6w后行體感誘發(fā)電位(Somatosensory evoked potentials，SSEPs)檢測(cè)，以評(píng)估脊髓損傷后感覺(jué)功能修復(fù)。局部注射后6w行冰凍切片免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament protein200，NF-200)、突觸素(s

6、ynaptophysin)及膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibrillaryacidic protein，GFAP），以觀察脊髓損傷局部軸突再生、突觸形成及膠質(zhì)瘢痕形成情況。
　　結(jié)果：
　　1.PTPσ-siRNA慢病毒載體成功感染大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞，并能有效沉默PTPσ基因mRNA(p＜0.001)及蛋白質(zhì)(p＜0.001)的表達(dá);脊髓損傷局部注射PTPσ-siRNA慢病毒載體亦可以有效沉默PTPσ基因mRNA(

7、p＜0.001)及蛋白質(zhì)(p＜0.001)的表達(dá)。
　　2.在CSPGs基質(zhì)上，PTPσ-RNAi組神經(jīng)元軸突再生長(zhǎng)度明顯較長(zhǎng)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001);同時(shí)，PTPσ-RNAi組神經(jīng)元軸突表現(xiàn)出更強(qiáng)的穿越CSPGs的能力，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。
　　3.脊髓損傷后6w行免疫組織化學(xué)染色。NF200染色結(jié)果表明，PTPσ-RNAi組脊髓損傷周圍軸突再生明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.00

8、1);突觸素染色結(jié)果顯示，PTPσ-RNAi組脊髓損傷周圍突觸形成明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001);而GFAP染色結(jié)果顯示，各組膠質(zhì)瘢痕形成并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　4.脊髓損傷后1d、1w各組間大鼠BBB評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，損傷后2w起各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分PTPσ-RNAi組均明顯優(yōu)于其他各組(p＜0.001);脊髓損傷后6w腳印學(xué)分析顯示，PTPσ-RNAi組大鼠在步長(zhǎng)(p＜0.001)、后

9、肢旋轉(zhuǎn)角度(p＜0.001)及后足間距離(p＜0.001)均呈現(xiàn)有意義的改善;6w體感誘發(fā)電位檢測(cè)顯示，PTPσ-RNAi組體感誘發(fā)電位P1及N1波的潛伏期明顯縮短(p＜0.001)，波幅明顯增大(p＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　慢病毒介導(dǎo)的siRNA能有效感染大鼠大腦皮層神經(jīng)元，并能沉默PTPσ基因表達(dá)，有效減輕CSPGs的軸突抑制作用;同時(shí)，局部注射PTPσ-RNAi慢病毒載體可有效促進(jìn)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能的恢復(fù)