煙堿對(duì)發(fā)育過程中海馬神經(jīng)元AMPA和NMDA受體的調(diào)制作用.pdf

1、第一部分
　　 煙堿對(duì)發(fā)育過程中海馬AMPA和NMDA受體的調(diào)制作用
　　 煙堿型乙酰膽堿能受體(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR,或稱煙堿受體)是由乙酰膽堿激活的陽離子選擇性通透的配體門控通道,是由α亞基(α2-α10)和β亞基(β2-β4)構(gòu)成的同源(α7-α9)或異源(αXβY)性五聚體。腦內(nèi)以異源性α4β2和同源性α7亞型受體最多。nAChR的表達(dá)在出生后早期即達(dá)到高峰

2、,并持續(xù)存在于整個(gè)成年過程。除了乙酰膽堿,nAChR還可以被煙堿激活。
　　 海馬位于大腦顳葉內(nèi),分別位于左右腦半球,是大腦邊緣系統(tǒng)的一部分,擔(dān)當(dāng)著記憶以及空間定位的作用。α7和α4β2這兩種乙酰膽堿受體在海馬區(qū)域有豐富的表達(dá),廣泛存在于海馬的錐體神經(jīng)元和中間神經(jīng)元。
　　 煙堿-膽堿能神經(jīng)元通過釋放乙酰膽堿,激活nAChR發(fā)揮作用。煙堿-膽堿能信號(hào)通路廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。一方

3、面,它與大腦的高級(jí)神經(jīng)-精神活動(dòng)(如覺醒、認(rèn)知、激惹、注意、疼痛和記憶等)密切相關(guān),另一方面,它參與了多種神經(jīng)病理性疾病(如老年性癡呆,帕金森氏癥,精神分裂癥,癲癇以及抽動(dòng)穢語綜合癥等)形成和發(fā)展；此外,它還與成癮的形成有關(guān)。
　　 突觸主要由軸突組成突觸前膜,樹突組成突觸后膜。谷氨酸是脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性遞質(zhì)。突觸前神經(jīng)元釋放谷氨酸,通過突觸間隙與突觸后神經(jīng)元膜上的谷氨酸受體結(jié)合而發(fā)揮作用,谷氨酸神經(jīng)通路與海馬功

4、能密切相關(guān)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸受體包括AMPA受體和NMDA受體,主要位于興奮性突觸的突觸后膜上,介導(dǎo)突觸傳導(dǎo),并參與突觸可塑性的形成和維持。AMPA受體的數(shù)量決定了突觸后神經(jīng)元興奮的程度,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響突觸傳遞的主要決定因素。它在突觸后膜區(qū)和突觸后膜外區(qū)存在的數(shù)量比的穩(wěn)定性對(duì)于大腦信息的儲(chǔ)存是具有非常重要的意義。因此,了解煙堿對(duì)AMPA受體和NMDA受體在大腦神經(jīng)元,尤其是在樹突上分布的影響具有重要意義。
　　 盡管對(duì)n

5、AChRs的研究由來已久,但人們對(duì)煙堿信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在大腦發(fā)育過程中的作用所知甚少。近年來的研究發(fā)現(xiàn),nAChRs激活與大腦各功能區(qū)域的發(fā)育成熟密切相關(guān)。出生后一周,海馬區(qū)域的α7和α4β2 nAChRs的表達(dá)水平即達(dá)到高峰,此時(shí)恰恰是谷氨酸突觸剛剛開始形成的時(shí)期,也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)許多區(qū)域自發(fā)性興奮性活動(dòng)開始活躍的時(shí)期。早期神經(jīng)系統(tǒng)局部通路的形成與信號(hào)的傳導(dǎo)同樣也受到煙堿信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。此外,有研究證明,哺乳動(dòng)物在圍產(chǎn)期過多地接觸煙堿

6、,其大腦的認(rèn)知功能會(huì)受到嚴(yán)重的損害,表明過度激活煙堿信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)可損害與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的大腦的發(fā)育。這些研究提示:nAChRs在大腦發(fā)育過程中對(duì)谷氨酸信號(hào)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟可能有著重要的影響。
　　 研究煙堿信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在大腦發(fā)育過程中對(duì)谷氨酸信號(hào)系統(tǒng)的影響,對(duì)了解神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育規(guī)律和機(jī)制,以及煙堿對(duì)神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)作用機(jī)理和損傷機(jī)制有重要的理論意義。
　　 目的:
　　 本研究采用電生理,免疫熒光染色以及wester

7、n blot等方法,以體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,體外培養(yǎng)腦片以及基因敲除小鼠腦片為模型,觀察煙堿及其信號(hào)通路對(duì)海馬神經(jīng)元谷氨酸釋放、對(duì)AMPA和NMDA受體在樹突表面分布及其在神經(jīng)元中表達(dá)的影響。
　　 方法:
　　 在體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元、小鼠海馬培養(yǎng)腦片以及基因敲除小鼠海馬腦片上,用全細(xì)胞膜片鉗記錄微小興奮性突觸后電流(mEPSC),分別分析煙堿及其信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)mEPSC頻率和幅度的影響。mEPSC反映了單個(gè)微小囊泡遞質(zhì)

8、的釋放,它的頻率反映了突觸前谷氨酸囊泡釋放的數(shù)目,它的幅度反映了突觸后受體(例如AMPA,NMDA受體)功能或數(shù)目的變化。
　　 在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上,采用雙電極外置刺激的方法,使用全細(xì)胞膜片鉗記錄AMPA和NMDA受體誘發(fā)興奮性突觸后電流(evoked-EPSC),觀察煙堿對(duì)這兩種受體evoked-EPSC峰值的影響。它的峰值反應(yīng)了最大的可激活的突觸電流。
　　 在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上,采用多通道快速給藥的方法,使用

9、全細(xì)胞膜片鉗記錄AMPA和NMDA受體誘發(fā)電流(AMPAR-induced和NMDAR-inducedcurrent)。
　　 在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上,用Western Blot檢測(cè)AMPA受體的蛋白表達(dá)水平。
　　 在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上,通過免疫熒光共染色GluR1,PSD95受體簇,觀察煙堿對(duì)AMPA受體在樹突表面分布的影響。
　　 為避免煙堿直接的α7和α4β2型煙堿受體作用,所有煙堿長(zhǎng)期暴露的細(xì)胞模型在

10、記錄前均使用含特異性α7和α4β2型煙堿受體阻斷劑MLA和DHβE的培養(yǎng)液取代含煙堿的培養(yǎng)液孵育1小時(shí)。
　　 結(jié)果:
　　 1.在體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元上記錄mEPSC,發(fā)現(xiàn)1μM煙堿持續(xù)作用7天后,mEPSC的頻率與對(duì)照組相比顯著增加；而煙堿持續(xù)作用1小時(shí),并不改變mEPSC的頻率。煙堿聯(lián)合應(yīng)用特異性α7型煙堿受體阻斷劑MLA共同作用7天后,mEPSC的頻率也無顯著變化。煙堿聯(lián)合應(yīng)用特異性α4β2型煙堿受體阻斷劑DH

11、βE7天后,mEPSC的頻率顯著增加。上述各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,mEPSC的幅度均無顯著差異。α7nAChRs廣泛地分布于突觸前和突觸后,其作用與受體分布的區(qū)域密切相關(guān):分布于突觸前可以調(diào)節(jié)突觸的釋放,分布于突觸后可以引起神經(jīng)元去極化。以上結(jié)果表明,煙堿主要通過α7nAChRs,促進(jìn)突觸前谷氨酸囊泡釋放的數(shù)目,而不影響突觸后受體功能或數(shù)目的變化,即煙堿主要通過作用于突觸前膜的α7型煙堿受體,促進(jìn)谷氨酸遞質(zhì)的釋放。
　　 2.在體

12、外培養(yǎng)的小鼠海馬腦片上,發(fā)現(xiàn)煙堿持續(xù)作用5天后,mEPSC的頻率顯著增加,幅度無顯著性變化。此結(jié)果進(jìn)一步表明,煙堿主要作用于突觸前膜的煙堿受體,促進(jìn)谷氨酸的釋放。
　　 3.在野生型小鼠(WT mice)、α7型煙堿受體基因缺陷小鼠(α7KO mice)和α4β2型煙堿受體基因缺陷小鼠(α4β2KO mice)腦片上記錄mEPSC,發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比,α7KO小鼠mEPSC的頻率顯著減?。欢?β2KO小鼠mEPSC的頻率無明顯

13、變化。3組小鼠的mEPSC幅度均無顯著差異。結(jié)果表明:內(nèi)源性的α7型煙堿受體膽堿能信號(hào)傳導(dǎo)缺陷導(dǎo)致谷氨酸釋放減少或功能性突觸減少。
　　 4.NMDA受體和AMPA受體共同存在于大多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸的突觸后膜,參與突觸的傳導(dǎo)和突觸的可塑性。實(shí)驗(yàn)中在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上記錄AMPA和NMDA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流(AMPA-evoked和NMDA-evokedEPSCs),發(fā)現(xiàn)煙堿作用7天后AMPA和NMDA受體介導(dǎo)的

14、的興奮性突觸后電流均顯著性增加,且NMDA/AMPA的比例保持不變。結(jié)果表明:煙堿主要通過突觸前機(jī)制促進(jìn)谷氨酸釋放,且對(duì)AMPA和NMDA受體介導(dǎo)的突觸成分作用強(qiáng)度相似。
　　 5.在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上使用GluR2缺失的AMPA受體亞型的特異性阻斷劑Naspm(100μmol/L)后,AMPA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流無明顯變化,且煙堿對(duì)此過程無顯著性影響。此外,AMPA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流并未呈現(xiàn)出明顯的內(nèi)向整流特性

15、。結(jié)果顯示:在我們的體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上,幾乎所有的AMPA受體均含有GluR2亞型,且煙堿不引起該亞型構(gòu)成的變化。
　　 6.在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上記錄AMPA和NMDA受體誘發(fā)電流(AMPAR-induced和NMDAR-induced current),發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和煙堿處理7天組的NMDA和AMPA誘發(fā)電流密度無顯著性變化。結(jié)果表明:煙堿對(duì)谷氨酸信號(hào)通路的影響是通過突觸前機(jī)制,而非突觸后機(jī)制。
　　 7.Weste

16、rn-blot結(jié)果顯示,煙堿長(zhǎng)期作用不改變海馬神經(jīng)元AMPA受體中GluR1以及GluR2/GluR3亞基的蛋白表達(dá)水平。
　　 8.在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上,通過免疫熒光共染色GluR1和PSD95受體簇,發(fā)現(xiàn)煙堿長(zhǎng)期作用組的GluR1受體簇,PSD95受體簇,以及樹突表面兩者共定位的受體簇顯著多于對(duì)照組。由于GluR1和PSD95受體簇的共定位是活性突觸的標(biāo)志,結(jié)果提示:煙堿促進(jìn)了AMPA受體在突觸的聚集,且這種聚集是由于新生

17、突觸造成的。
　　 結(jié)論:
　　 1.煙堿主要作用于突觸前膜的α7型煙堿受體促進(jìn)谷氨酸的釋放,且對(duì)AMPA和NMDA受體介導(dǎo)的突觸成分作用強(qiáng)度相似。
　　 2.α7型煙堿受體-膽堿能信號(hào)傳導(dǎo)缺陷將導(dǎo)致谷氨酸釋放減少或功能性突觸形成減少。
　　 3.煙堿促進(jìn)AMPA受體在突觸區(qū)域的聚集,但不影響細(xì)胞膜表面總體分布水平和總蛋白表達(dá)水平。
　　 第二部分卡維地洛對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元瞬時(shí)外向鉀電流和延遲整

18、流鉀電流的作用
　　 研究背景:卡維地洛是β-腎上腺素受體拮抗劑。除能阻斷β-受體外,卡維地洛還具有許多非β-受體拮抗效應(yīng)?？ňS地洛脂溶性高,容易透過血腦屏障到達(dá)大腦。研究證明,卡維地洛在腦缺血性損傷和其它損傷時(shí)有很好的神經(jīng)元保護(hù)作用,但其機(jī)理不明；目前認(rèn)為與清除自由基、金屬螯合、以及抑制神經(jīng)元膜離子通道(如Na、Ca)和受體(如NMDA受體)而產(chǎn)生的抗炎、抗細(xì)胞凋亡和線粒體保護(hù)作用有關(guān)。
　　 鉀離子(K+電流)可以調(diào)

19、節(jié)神經(jīng)元的興奮性,參與多種神經(jīng)生理活動(dòng)；此外,許多病理狀況也與神經(jīng)元鉀離子通道的異?；顒?dòng)有關(guān)。海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元上的外向鉀電流主由兩個(gè)電壓門控性鉀電流成分組成,分別是瞬時(shí)外向鉀電流(IA)和延遲整流鉀電流(IK)。IA是生理狀態(tài)下與細(xì)胞興奮活動(dòng)密切相關(guān)的鉀電流,而IK是病理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)鉀離子大量外流的主要通道。有報(bào)道,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的很多病理狀態(tài)與K+外流的增多有關(guān)(如缺氧,缺血,低血糖和抑郁癥等)等。越來越多的證據(jù)表明,IK增加可誘

20、導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡。
　　 上述研究的結(jié)果提示:卡維地洛有可能通過影響K+通道而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用的。但迄今為止,尚未見有卡維地洛通過影響K+通道而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用的報(bào)道。
　　 目的:
　　 本研究采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究卡維地洛對(duì)離體大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元鉀電流(IK和IA)的影響。
　　 方法:
　　 在急性分離的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元上應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究卡維地洛對(duì)瞬時(shí)外向鉀電流(I

21、A)和延遲整流鉀電流(IK)的作用。
　　 結(jié)果:
　　 卡維地洛(0.1-3μmol/L)呈濃度依賴性、電壓非依賴性地抑制了IK,其半數(shù)抑制濃度IC50為1.3μmol/L;對(duì)IA峰值無明顯影響。進(jìn)一步的通道動(dòng)力學(xué)表明,IA和IK的激活曲線未受到1μmol/L卡維地洛影響,但其穩(wěn)態(tài)失活曲線顯著左移；此外卡維地洛還延緩了它們的復(fù)活。對(duì)于卡維地洛對(duì)IK峰值的選擇性作用于的機(jī)制我們也做了初步探討,研究發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的α1、β受體激