京尼平交聯(lián)兔脫細(xì)胞氣管支架原位移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、先天性畸形、創(chuàng)傷、腫瘤、感染、損傷后長(zhǎng)期氣管插管和某些自身免疫性疾病，可以導(dǎo)致氣管狹窄或壞死，需要?dú)夤苤亟ɑ蛞浦病８鞣N良性或惡性氣管病變患者的主要治療方法為氣管切除術(shù)。然而，當(dāng)病變的氣管長(zhǎng)度達(dá)到兒童的30％或成人的50％時(shí)，切除病變氣管直接端端吻合將帶來巨大風(fēng)險(xiǎn)。組織工程是結(jié)合工程技術(shù)和生物學(xué)原理應(yīng)用于功能性組織替代的一個(gè)新興研究，以促進(jìn)受損組織再生，有望成為長(zhǎng)段氣管重建的有效治療手段。
　　本研究以新西蘭兔為對(duì)象，通過脫細(xì)胞及京

2、尼平交聯(lián)方法得到氣管支架，并種植自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，運(yùn)用生長(zhǎng)因子，原位移植氣管，綜合評(píng)估原位移植效果，監(jiān)測(cè)其免疫原性和排斥反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，通過梯度離心法獲取自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞，并使用細(xì)胞示蹤劑綠色熒光蛋白標(biāo)記自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞。含有綠色熒光蛋白標(biāo)記的自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞可以在脫細(xì)胞氣管支架上分化為軟骨細(xì)胞，這一實(shí)驗(yàn)過程避免了干細(xì)胞在體外培養(yǎng)，大大縮短了組織工程氣管的制備周期，節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，為需要組織工程氣管移植的患者爭(zhēng)取了更多

3、的治療時(shí)間。
　　第一部分京尼平交聯(lián)脫細(xì)胞氣管支架種植自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)原位移植研究
　　目的:
　　通過對(duì)由京尼平交聯(lián)的脫細(xì)胞氣管支架進(jìn)行原位移植，并在術(shù)中種植自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行研究，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)分化為軟骨細(xì)胞的情況，并對(duì)上皮細(xì)胞再生情況及移植后炎癥排斥反應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　方法:
　　1.脫細(xì)胞氣管支架的制備;
　　2.脫細(xì)胞氣管支架的體外檢測(cè);
　　3.自體骨髓間

4、充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定;
　　4.氣管原位移植;
　　5.氣管原位移植后檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.氣管脫細(xì)胞后，上皮細(xì)胞清除完全，軟骨細(xì)胞大部分被清除，Ⅱ型膠原保留完整;
　　2.通過全骨髓培養(yǎng)貼壁篩選法獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)至第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，具有多項(xiàng)分化潛能;
　　3.脫細(xì)胞后京尼平交聯(lián)的氣管支架加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原位移植后，炎癥反應(yīng)程度與自體原位移植相似，種植的骨髓間充質(zhì)干

5、細(xì)胞在體內(nèi)可以分化為軟骨細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1.通過去污劑-聯(lián)合酶法獲取了脫細(xì)胞氣管支架，運(yùn)用天然交聯(lián)劑京尼平交聯(lián)得到了京尼平交聯(lián)脫細(xì)胞氣管支架;
　　2.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離純化了自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)特征及多向分化潛能鑒定了自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;
　　3.種植有自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的脫細(xì)胞氣管支架在原位移植實(shí)驗(yàn)中取得成功，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)分化為軟骨細(xì)胞，未發(fā)生明顯的

6、排斥反應(yīng)。
　　第二部分京尼平交聯(lián)脫細(xì)胞氣管支架種植自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞的體內(nèi)原位移植研究
　　目的:
　　通過對(duì)含有綠色熒光蛋白示蹤劑的骨髓單個(gè)核細(xì)胞在京尼平交聯(lián)的脫細(xì)胞氣管支架原位移植中的研究，觀察骨髓單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白含量，評(píng)估種植的自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的情況，并對(duì)使用生長(zhǎng)因子后外周血中單個(gè)核細(xì)胞含量進(jìn)行評(píng)價(jià)，探討自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞在組織工程氣管移植中的作用。
　　方法:
　　1.脫細(xì)

7、胞氣管支架的制備;
　　2.293T細(xì)胞的復(fù)蘇及培養(yǎng);
　　3.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的獲取;
　　4.293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染;
　　5.自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞的獲取;
　　6.慢病毒的獲取及細(xì)胞的感染;
　　7.氣管原位移植;
　　8.氣管移植后單個(gè)核細(xì)胞含量檢測(cè)及單個(gè)核細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞情況的檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.293T轉(zhuǎn)染含有綠色熒光蛋白質(zhì)粒后細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，并能合成含有綠色熒光蛋白可

8、以感染其他細(xì)胞的慢病毒;
　　2.含有綠色熒光蛋白的慢病毒可以感染骨髓單個(gè)核細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可以看到細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光出現(xiàn);
　　4.種植有含綠色熒光蛋白的自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞的京尼平交聯(lián)脫細(xì)胞氣管支架原位移植后，種植的骨髓單個(gè)核在體內(nèi)可以分化為軟骨細(xì)胞，在分化成的軟骨細(xì)胞中含有綠色熒光蛋白。
　　結(jié)論:
　　1.綠色熒光蛋白可以在293T細(xì)胞內(nèi)被包裝在慢病毒內(nèi)，在不影響其他細(xì)胞活性的情況下將綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)入其他

9、細(xì)胞中;
　　2.通過梯度離心得到的自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞可以被含有綠色熒光蛋白的慢病毒感染，綠色熒光蛋白在不影響骨髓單個(gè)核細(xì)胞的情況下對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記;
　　3.通過慢病毒感染的方法對(duì)自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行示蹤，鑒定氣管移植后再生的軟骨細(xì)胞由種植的自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞分化而來;
　　4.自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞在原位移植的京尼平交聯(lián)脫細(xì)胞氣管支架上可以分化為軟骨細(xì)胞，這一過程避免了干細(xì)胞體外培養(yǎng)過程，節(jié)省了時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本。與骨髓