不同生存環(huán)境對馬爾尼菲青霉乙醛酸循環(huán)的影響及其意義的研究.pdf

1、研究目的: 1.觀察溫度、葡萄糖濃度、一氧化氮對馬爾尼菲青霉的生長及其乙醛酸循環(huán)、糖異生、糖酵解代謝過程的影響。 2.觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境變化對馬爾尼菲青霉的生長及其乙醛酸循環(huán)、糖異生、糖酵解代謝過程的影響。 3.探討乙醛酸循環(huán)在馬爾尼菲青霉致病中的作用。 實(shí)驗(yàn)對象和方法: 1.馬爾尼菲青霉菌絲相、酵母相及分生孢子的獲?。厚R爾尼菲青霉SUMS0152株，接種于裝有20ml沙堡弱葡萄糖液體培養(yǎng)基的搖

2、瓶中，25℃150 r/min振蕩孵育72h，離心收集菌絲體；接種于腦心浸汁(BHI)固體培養(yǎng)基上，每3天傳代1次，數(shù)次傳代后，至鏡下觀察基本為酵母相細(xì)胞時，再接種于裝有20ml BHI液體培養(yǎng)基的搖瓶中，37℃150 r/min振蕩孵育72h，離心收集酵母相細(xì)胞；將馬爾尼菲青霉接種于PDA培養(yǎng)基，25℃孵育14d，用無菌生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面，過濾去除菌絲，離心收取分生孢子。 2.實(shí)驗(yàn)分組： 第一類分組：分為4組，每組

3、4個樣本。菌絲相含糖培養(yǎng)組(MG)將菌絲懸于20m10.17﹪YNB+2﹪葡萄糖的培養(yǎng)基中；菌絲相無糖培養(yǎng)組(MN)將菌絲懸于20ml 0.17﹪YNB+2﹪乙酸鹽的培養(yǎng)基中，兩組均25℃150 r/min振蕩孵育12h。酵母相含糖培養(yǎng)組(YG)將酵母細(xì)胞懸于20m10.17﹪YNB+2﹪葡萄糖的培養(yǎng)基中；酵母相無糖培養(yǎng)組(YN)將酵母細(xì)胞懸于20ml 0.17﹪’YNB+2﹪乙酸鹽的培養(yǎng)基中，兩組均37℃ 150 r/min振蕩孵育1

4、2h。以上述各組培養(yǎng)基加入1.5﹪瓊脂制成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基，接種P.m分生孢子，觀察菌落生長情況；以改良SDA、BHI接種P.m分生孢子，25℃、37℃觀察菌落生長情況。 第二類分組：馬爾尼菲青霉酵母細(xì)胞按接種的培養(yǎng)基(pH5)分組，高糖(1﹪葡萄糖)培養(yǎng)基中按加入0mM、1mM、2mM、3mM的NaNO<,2>分為H0、H1、H2、H3共4組；低糖(0.1﹪葡萄糖)培養(yǎng)基中按加入0mM、1mM、2mM、3mM的NaNO<,2>

5、分為L0、L1、L2、L3共4組，每組各4個樣本。 第三類分組：分為4組，每組4個樣本。0組將馬爾尼菲青霉接種于DMEM(0.45﹪葡萄糖)細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃ 150rpm孵育48h；1組將馬爾尼菲青霉分生孢子與RAW264.7細(xì)胞(小鼠單核巨噬細(xì)胞系)共培養(yǎng)于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃5﹪CO<,2>的溫箱中孵育6h，棄去細(xì)胞外馬爾尼菲青霉繼續(xù)孵育48h；2組在1組的基礎(chǔ)上，于培養(yǎng)體系中加入rMulFN-γ和LPS以刺激R

6、AW264.7細(xì)胞;3組在2組的基礎(chǔ)上，于培養(yǎng)體系中加入一氧化氮合酶抑制劑LNMMA。1、2、3組棄去細(xì)胞外馬爾尼菲青霉，獲取細(xì)胞內(nèi)馬爾尼菲青霉作為樣本。 3.熒光定量RT-PCR檢測： 提取各實(shí)驗(yàn)組馬爾尼菲青霉樣本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用各自的特異性引物進(jìn)行real-time PCR，分析各組馬爾尼菲青霉ICL1、PCKl、PFK2的基因相對轉(zhuǎn)錄水平。 4.ICL1酶活性檢測： 采用玻璃珠破

7、壁獲取馬爾尼菲青霉具有活性的總蛋白，加入異檸檬酸37℃孵育1h，加入6.4M鹽酸胍終止反應(yīng)后再加入2-硝基苯酸，室溫反應(yīng)10min，采用分光光度計(jì)檢測最終產(chǎn)物硝基苯酸的A<,412>值，以校正的A<,412>值反映ICL1蛋白的量及活性。 5.NO含量檢測： 按照NO檢測試劑盒說明書操作，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液、20 μ mol/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水各1ml，加入反應(yīng)試劑一0.8ml、試劑二0.4ml，混勻后，放置10mi

8、n，4000rpm離心10min，取澄清上清液0.8ml，加入顯色劑0.4ml，混勻，15min后在550nm檢測吸光度OD值，根據(jù)公式計(jì)算NO含量。 6.馬爾尼菲青霉生長情況的比較： 固體培養(yǎng)基上采用菌落直徑進(jìn)行比較。液體培養(yǎng)基中馬爾尼菲青霉酵母細(xì)胞懸液經(jīng)50W超聲波處理3min后，采用DU70分光光度儀檢測340nm吸光度，比較A<,340>值。巨噬細(xì)胞內(nèi)馬爾尼菲青霉采用菌落計(jì)數(shù)進(jìn)行比較。 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：

9、 正態(tài)分布計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩因素單獨(dú)效應(yīng)、主效應(yīng)及交互效應(yīng)采用2×2析因分析；非正態(tài)分布計(jì)量資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)，兩變量相關(guān)關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)分析。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，顯著性水準(zhǔn)α設(shè)為0.05。 結(jié)果: 1.溫度、葡萄糖濃度對馬爾尼菲青霉生長及乙醛酸循環(huán)的影響相同葡萄糖濃度下，菌絲相較酵母相生長更迅速(p<0.05)；隨著葡萄糖濃度降低，

10、菌絲相和酵母相生長速度均下降(p<0.05)，但酵母相生長速度下降幅度較小。 2.一氧化氮對馬爾尼菲青霉生長及乙醛酸循環(huán)的影響一氧化氮對馬爾尼菲青霉酵母相ICL1、PCK1、PFK2的轉(zhuǎn)錄及ICL1的蛋白表達(dá)和活性具有明顯抑制作用，隨著一氧化氮濃度上升，抑制作用增強(qiáng)(p<0.01)。低糖相對于高糖對ICL1轉(zhuǎn)錄及其蛋白表達(dá)和活性具有誘導(dǎo)效應(yīng)，隨著一氧化氮濃度上升，該誘導(dǎo)效應(yīng)明顯減弱(p<0.01)。 一氧化氮對低糖和高糖

11、培養(yǎng)基中的馬爾尼菲青霉的生長均有抑制作用，并且隨一氧化氮濃度上升抑制作用增強(qiáng)(P<0.01)。隨著一氧化氮濃度上升，低糖組相對于高糖組的存活率也明顯下降(P<0.01)。低糖對ICL1轉(zhuǎn)錄水平的誘導(dǎo)效應(yīng)，與馬爾尼菲青霉的低糖存活率呈正相關(guān)(r<,s>=0.99，P<0.01)。 3.巨噬細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境對馬爾尼菲青霉生長及乙醛酸循環(huán)的影響ICL1、PCK1轉(zhuǎn)錄水平及ICL1的蛋白表達(dá)和活性，均顯示為3組>2組>1組>0組(0組為細(xì)胞

12、外，1組為細(xì)胞內(nèi)，2組為活化的細(xì)胞內(nèi)，3組為活化但不能產(chǎn)生NO的細(xì)胞內(nèi))，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PFK2轉(zhuǎn)錄水平顯示0組>1組>3組>2組，僅2組與其他組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 經(jīng)IFN-γ、LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的活性氮成分明顯增加(P<0.01)，對細(xì)胞內(nèi)馬爾尼菲青霉生長有明顯抑制作用(P<0.01)。抑制活性氮成分的產(chǎn)生，可恢復(fù)馬爾尼菲青霉的生長。 結(jié)論: 1.首次設(shè)計(jì)相關(guān)引物，采用熒光定量RT

13、-PCR檢測了馬爾尼菲青霉ICL1、PCK1、PFK2的轉(zhuǎn)錄水平，各產(chǎn)物均為單一片段，符合檢測標(biāo)準(zhǔn)。 2.建立了小鼠巨噬細(xì)胞系吞噬馬爾尼菲青霉的共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)IFN γ等刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生微量的NO，不能有效地殺滅P.m；經(jīng)IFN γ等刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生較大量的NO，可明顯殺滅P.m；刺激后加入NOS抑制劑的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO明顯減少，對P.m殺滅作用減弱；共培養(yǎng)體系可很好地模擬正常宿主或免疫缺陷宿主巨噬細(xì)胞與P.m的相互作

14、用。 3.37℃生長和葡萄糖缺乏的環(huán)境均可誘導(dǎo)乙醛酸循環(huán)、糖異生代謝加強(qiáng)，使碳源向葡萄糖方向流動，兩因素的誘導(dǎo)作用具有協(xié)同效應(yīng)。在葡萄糖缺乏的環(huán)境中，馬爾尼菲青霉酵母相的乙醛酸循環(huán)、糖異生較菌絲相更為活躍，使其酵母相細(xì)胞更能耐受低糖的微環(huán)境。 4.NO抑制乙醛酸循環(huán)、糖異生、糖酵解，抑制P.m酵母相細(xì)胞生長，抑制作用隨NO濃度上升而增強(qiáng)。NO對低糖環(huán)境下P.m酵母相細(xì)胞生長的抑制作用更明顯，說明NO可在一定程度上通過抑制

15、乙醛酸循環(huán)來殺滅馬爾尼菲青霉酵母相細(xì)胞。 5.在未經(jīng)IFN γ刺激的巨噬細(xì)胞內(nèi)，馬爾尼菲青霉乙醛酸循環(huán)、糖異生代謝加強(qiáng)，P.m能繼續(xù)生存；在經(jīng)：IFN γ刺激但不能產(chǎn)生足夠NO的巨噬細(xì)胞內(nèi)，P.m乙醛酸循環(huán)、糖異生代謝進(jìn)一步加強(qiáng)，P.m仍能生存：在經(jīng)IFN γ刺激產(chǎn)生足夠NO的巨噬細(xì)胞內(nèi)，P.m乙醛酸循環(huán)、糖異生代謝被抑制，P.m被大量殺滅。P.m在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存既與其乙醛酸循環(huán)的活性明顯相關(guān)，也取決于巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)。乙醛

16、酸循環(huán)在P.m致病過程中起著重要作用，同時宿主的免疫功能也是發(fā)病與否的關(guān)鍵因素。 6.馬爾尼菲青霉ICL1的表達(dá)可能存在多途徑、多層次的調(diào)控；ICL1與其它可能的致病因子之間是否存在相互調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)，目前也不甚清楚。所以下一步研究計(jì)劃包括：1)對馬爾尼菲青霉ICL1蛋白表達(dá)的具體調(diào)節(jié)過程和機(jī)制進(jìn)行深入研究；2)篩選馬爾尼菲青霉ICL1基因及其它基因缺陷株，進(jìn)一步尋找馬爾尼菲青霉的致病因子，并探討這些致病因子間的相互關(guān)系?；谝陨涎?/p>