鰻弧菌(Vibrio anguillarum)M3菌株T6SS基因簇的克隆及其功能的初步研究.pdf

1、細(xì)菌T6SS分泌系統(tǒng)(TypeⅥ secretion system，T6SS)是最近報(bào)道的-個(gè)新的蛋白分泌系統(tǒng)。根據(jù)鰻弧菌(Vibrio anguillarum)Fosmid文庫(kù)獲得的部分基因組序列信息，發(fā)現(xiàn)鰻弧菌存在T6SS分泌系統(tǒng)的同源基因。通過(guò)同源克隆、genomic Walking等方法，獲得了鰻弧菌M3菌株的T6SS分泌系統(tǒng)基因簇。該基因簇含有22879bp，編碼16個(gè)ORF，GC含量為46.93％，與V．cholerae有最

2、高相似性，為87％。為了確定鰻弧菌M3的T6SS基因的轉(zhuǎn)錄是否受-個(gè)操縱子調(diào)控，通過(guò)跨兩個(gè)連續(xù)基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR和生物信息學(xué)分析結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)在鰻弧菌T6SS基因簇的基因vaa108上游存在-個(gè)啟動(dòng)子，來(lái)調(diào)控M3整個(gè)T6SS基因的轉(zhuǎn)錄。 為了研究T6SS基因的功能，通過(guò)In-frame-deletion的方法構(gòu)建了7個(gè)基因的缺失突變株，研究了這些突變株的生長(zhǎng)、泳動(dòng)性、胞外酶產(chǎn)生和毒力等方面的變化。結(jié)果表明，在生長(zhǎng)方面，4株

3、突變株在在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速度比野生型菌株顯著加快(p＜0.05)、1株突變株的生長(zhǎng)稍微減慢、2株突變株的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯變化；在泳動(dòng)性方面，2株突變株的泳動(dòng)性增強(qiáng)(P＜0.05)，其他突變株則沒(méi)有顯著變化；1株突變株的α-葡萄糖苷酶活性明顯高于野生株。以突變株對(duì)藍(lán)曼龍魚(Trichoqaster trichopterus)進(jìn)行攻毒檢測(cè)半數(shù)致死量(LD50)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4株突變株的毒力沒(méi)有明顯變化或變化不明顯，3株突變株的毒力37～223倍

4、。這些結(jié)果表明，鰻弧菌T6SS可能參與了細(xì)菌的毒力。 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，鰻弧菌基因簇內(nèi)命名為vaa117的基因編碼sigma54轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。 研究發(fā)現(xiàn)，vaa117基因缺失突變后，鰻弧菌菌膜形成能力有明顯變化，在48-72h菌膜形成不僅快于野生型菌株，而且菌膜形成量也高于野生型。表明鰻弧菌的菌膜形成受到vaa117基因的負(fù)調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，vaa117基因缺失突變后，鰻弧菌溶血素共調(diào)蛋白(hemolysi-cor