簇毛麥Hv-CMPG基因克隆及其功能初步分析.pdf

1、小麥白粉病是由白粉病菌（Ergsiphe greminis f.sp.tritici）引起的世界性專性寄生真菌病害，在中國和世界上許多國家小麥生產(chǎn)中危害日趨嚴(yán)重。培育抗性品種是控制白粉病的有效途徑。來自于小麥近緣物種簇毛麥的抗白粉病基因Pm21對白粉病抗性強、抗譜廣，已經(jīng)作為我國小麥抗白粉病育種的新一代抗源廣泛利用。鑒定Pm21基因發(fā)揮抗病作用過程中所涉及的轉(zhuǎn)錄因子、信號傳導(dǎo)途徑和重要防衛(wèi)反應(yīng)基因，克隆抗白粉病相關(guān)基因，對于研究廣譜抗性

2、機理以及利用基因工程手段提高小麥對白粉病的抗性具有重要意義。
　　 在前期研究中以攜帶Fm21的簇毛麥為研究對象，利用基因芯片技術(shù)，研究白粉菌誘導(dǎo)前后的轉(zhuǎn)錄譜，篩選白粉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達的基因，并分析其中具抗病結(jié)構(gòu)域的基因和抗病相關(guān)基因。在此基礎(chǔ)上，本研究首先根據(jù)芯片雜交結(jié)果中上調(diào)表達的與植物抗病基因有關(guān)的14個探針序列設(shè)計引物，利用RT-PCR驗證芯片雜交結(jié)果。結(jié)果表明，14對引物中的7對可以在簇毛麥cDNA中擴增出產(chǎn)物，且7個基

3、因經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)后都增強，但表達模式存在差異。其中Contig3875和Contig16352分別是來源于擬南芥的轉(zhuǎn)錄因子和水稻中推測的鋅指轉(zhuǎn)座子蛋白（ZIP），它們只在誘導(dǎo)24小時的樣品中檢測到了表達量，在非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)48小時后的樣品中則檢測不到。Contig5557、Contig13968和Contig25420這3個探針分別是水稻中推測的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、推測的七個跨膜蛋白和水稻中病原菌誘導(dǎo)早期快速激發(fā)蛋白，它們在誘導(dǎo)后所有樣

4、品中的表達量都比在非誘導(dǎo)樣品中表達量大，但隨著誘導(dǎo)時間的延長，表達量漸漸減少.它們的表達模式與曹愛忠（2005）根據(jù)上調(diào)表達的探針Contig17515克隆到的簇毛麥中位于6VS上的絲氨酸/蘇氨酸激酶基因（Hv-S/TPK）表達模式相似。探針Contig8614和Contig16386分別來源于擬南芥的鈣結(jié)合蛋白和抗病蛋白，它們在誘導(dǎo)24小時表達量增強、48小時表達量有所下降、72小時表達量又升高。該結(jié)果證實了基因芯片雜交篩選出的上調(diào)表

5、達基因的結(jié)果是可靠的。
　　 基因芯片雜交結(jié)果表明探針Contig25420在誘導(dǎo)的抗病簇毛麥中表達量是在非誘導(dǎo)的抗病簇毛麥中的表達量的22.1倍，而且該基因只在抗病簇毛麥中受白粉菌誘導(dǎo)表達.探針Contig25420來自于水稻中推測的早期病原菌誘導(dǎo)快速反應(yīng)基因，推測可能與簇毛麥的抗白粉病性有關(guān)。本研究進一步根據(jù)探針Contig25420序列設(shè)計引物，用PCR方法篩選經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)的簇毛麥葉片cDNA文庫，獲得一個全長cDNA克隆

6、。序列分析結(jié)果表明，該全長基因有1692堿基，開放閱讀框從93bp-1493bp，編碼467個氨基酸，具有Cys、Met、Pro和Gly四個保守的氨基酸殘基，與水稻、擬南芥、煙草、歐芹病原菌誘導(dǎo)后快速表達的CMPG基因具有較高的相似性，故將該基因命名為Hv-CMPG。因含有一個E3連接酶中的U-Box保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域決定E3連接酶對特異性底物的識別。
　　 為了探明該基因的表達模式，本研究以非誘導(dǎo)、誘導(dǎo)5 min、15 mi

7、n、30 min、60min、2hr、4hr、24hr、48hr的抗病簇毛麥葉片cDNA為模板進行RT-PCR。結(jié)果表明Hv-CMPG在粉菌誘導(dǎo)后白粉菌誘導(dǎo)后30min至60min期間達到峰值，然后緩慢下降并維持在較低水平，表明該基因在簇毛麥中受白粉菌誘導(dǎo)后快速表達。
　　 為了研究該基因在簇毛麥抗白粉病反應(yīng)中的功能，首先構(gòu)建了Hv-CMPG+GUS瞬間表達融合載體，用基因槍法分別用該融合載體和GUS表達載體轟擊感白粉病小麥品種

8、蘇麥3號，高密度接種白粉病菌，觀察白粉病菌侵入GUS陽性細胞情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)化（Hv-CMPG+Ahc1/2）的兩張葉片的細胞表面的孢子都能夠正常萌發(fā)，長出初生芽管和附著孢芽管，附著孢芽管末端形成附著孢緊緊貼附于表皮細胞表面并向表皮細胞壁的方向形成侵入釘，但是形成菌絲分生孢子鏈的細胞數(shù)明顯偏少，約占總統(tǒng)計細胞數(shù)的70％；而對照即只轉(zhuǎn)化GUS基因（Ahc1/2）的兩張葉片表皮細胞可觀察到很多明顯的串狀的分生孢子鏈，占總統(tǒng)計細胞數(shù)的約6