miR-17-92基因簇在骨肉瘤中表達和功能的初步研究.pdf

1、目的：
　　微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼多功能小分子RNA。其作用機制是通過與下游目的靶基因mRNA分子的3′端非編碼區(qū)結(jié)合并抑制該mRNA分子的翻譯。本實驗研究miR-17-92基因簇及成員miRN As在骨肉瘤組織和骨肉瘤細胞株中的表達及miRNA-19b（miR-19b）在骨肉瘤細胞中的功能，并且探索其可能的分子機制。
　　方法：
　　運用普通PCR和實時定量PCR方法檢測21例

2、骨肉瘤組織和同一患者的鄰近正常骨組織中miR-17-92基因簇的表達，并根據(jù)臨床資料評估m(xù)iR-17-92基因簇的臨床意義。運用實時定量PCR檢測分析MG-63、U-2 OS和SaOS-2骨肉瘤細胞和人成骨細胞hFOB1.19中miR-17-92基因簇6個成員miRNA的表達情況，篩選單個miRNA和骨肉瘤細胞株進行下一步實驗；構(gòu)建miR-19b Inhibitor質(zhì)粒，使用miR-19b Inhibitor和陰性對照（質(zhì)粒NC）轉(zhuǎn)染骨

3、肉瘤MG-63細胞；利用實時定量PCR檢測MG-63細胞中miR-19b的表達變化，運用MTS方法觀察轉(zhuǎn)染前后MG-63細胞增殖能力的變化；流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染前后MG-63細胞周期情況；Tunel法和流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染前后MG-63細胞凋亡情況；Transwell細胞侵襲實驗觀察轉(zhuǎn)染前后MG-63細胞侵襲能力的改變。運用TargetSca n、M iRa nda、MiRD、RNA22和 Mirwalk等生物信息學方法對 miR-19b靶

4、基因進行預測，Western blot和實時定量PCR方法檢測了轉(zhuǎn)染前后MG-63細胞中MFN1的表達；雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炶b定miR-19b與靶基因MFN1之間的關系。
　　結(jié)果：
　　1. miR-17-92基因簇在所有的骨肉瘤組織中都有表達，且在腫瘤組織中的表達明顯高于在正常骨組織中的表達，同時miR-17-92基因簇的表達與患者的年齡、性別、腫瘤部位、分化程度無關，而與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移相關；
　　2．六個成員mi

5、RNAs中，miR-19b在MG-63、U-2 OS和SaOS-2骨肉瘤細胞株中明顯高表達；miR-19b在骨肉瘤 MG-63細胞中表達最高，因而選擇 miR-19b和MG-63細胞進行后續(xù)實驗；
　　3．外源性降低miR-19b的表達能顯著抑制骨肉瘤MG-63細胞的增殖、侵襲能力，使細胞周期停滯在G1期，同時促進細胞凋亡；
　　4．miR-19b直接負性調(diào)控抑癌基因MFN1的表達。使用生物信息學方法分析，預測出MFN1是m

6、iR-19b的靶基因。雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實MFN1是miR-19b的下游靶點；實時定量PCR和WesternBlots進一步證實轉(zhuǎn)染miR-19b inhibitor后，靶蛋白表達出現(xiàn)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1. miR-17-92基因簇在骨肉瘤組織和骨肉瘤細胞中高表達， miR-17-92基因簇高表達和骨肉瘤患者遠期發(fā)生轉(zhuǎn)移相關，與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度等無關，提示miR-17-92基因簇高表達潛在的導致腫瘤

7、轉(zhuǎn)移，其可以作為骨肉瘤患者預后的一個指標。
　　2．miR-19b在骨肉瘤發(fā)病是致癌性miRNA。抑制miR-19b表達，可以明顯抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖和侵襲能力，促進凋亡；提示miR-19b表達水平可能參與細胞功能的分子調(diào)控，有可能成為骨肉瘤治療的分子靶點。
　　3．在MG-63細胞中miR-19b和抑癌基因MFN1的蛋白和mRNA表達水平呈現(xiàn)負相關性。miR-19b在骨肉瘤中的顯著上調(diào)可能通過負調(diào)控下游靶基因MFN