小鼠脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)化療損傷組織趨化作用以及修復(fù)作用的觀察.pdf

1、研究背景：目前治療血液系統(tǒng)各類惡性疾病的常用手段包括化療、放療、異基因造血干細(xì)胞移植等。這些治療手段常常導(dǎo)致機(jī)體相應(yīng)的組織器官出現(xiàn)不同程度的損傷。除了受損臟器自身功能出現(xiàn)相應(yīng)表現(xiàn)外，免疫系統(tǒng)和粘膜屏障功能的破壞還會(huì)使機(jī)體招致致命性的感染。近年來造血干細(xì)胞移植和細(xì)胞因子的應(yīng)用日趨廣泛，許多研究致力于將干細(xì)胞應(yīng)用于各種受損的組織器官，以利用其多向分化潛能以及分泌細(xì)胞因子等發(fā)揮修復(fù)組織的作用。
　　脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)來源于

2、脂肪組織，是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，還有分離方便、免疫原性小的特點(diǎn)，允許同種異體移植而沒有免疫排斥，不具有倫理爭(zhēng)議等優(yōu)勢(shì)。具有定向分化、免疫調(diào)節(jié)等多種作用，因而得到了廣泛關(guān)注。目前有許多研究致力于對(duì)ADSCs修復(fù)作用觀察與研究。從而為組織損傷修復(fù)帶來新的解決方法。
　　本研究擬利用脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，在小鼠體內(nèi)對(duì)化療損傷臟器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療修復(fù)，觀察其是否對(duì)損傷組織具有修復(fù)能力。實(shí)驗(yàn)共分為兩部分，一部分是應(yīng)用重組腺病毒(p

3、Adxsi–EGFP)轉(zhuǎn)染ADSCs，將熒光標(biāo)記的細(xì)胞注入組織受損的個(gè)體內(nèi)，利用熒光物質(zhì)的示蹤作用觀察ADSCs進(jìn)入體內(nèi)后的分布情況以及對(duì)損傷組織有無趨化能力。另一部分研究是將ADSCs注入受損個(gè)體內(nèi)，觀察化療后受損組織在ADSCs的作用下，修復(fù)的速度及程度上與空白組相比是否存在優(yōu)勢(shì)。
　　目的：
　　1.采用化療處理的小鼠，將熒光標(biāo)記的ADSCs注入體內(nèi)，觀察ADSCs在體內(nèi)的分布情況及對(duì)損傷組織是否具有趨化能力。為干細(xì)胞

4、對(duì)受損組織的修復(fù)作用提供證據(jù)。
　　2.通過對(duì)比ADSCs注入后治療組與對(duì)照組受損組織的修復(fù)程度與速度的差異，間接證明ADSCs是否對(duì)受損組織具有修復(fù)能力。
　　方法：
　　1.通過體外分離培養(yǎng)BALB/c小鼠脂肪組織獲得ADSCs，采用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用pAdxsi-EGFP標(biāo)記ADSCs，用熒光顯微鏡查看轉(zhuǎn)染率，并進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖活性。
　　2.BALB/c小鼠6只，隨機(jī)分為

5、2組，其中3只經(jīng)由腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)建立化療損傷的小鼠模型，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，3只腹腔注射生理鹽水作為對(duì)照組。將標(biāo)記的ADSCs由小鼠尾靜脈注射入6只小鼠體內(nèi)，觀察點(diǎn)為第3、7、10、14天，采用活體成像技術(shù)檢測(cè)熒光標(biāo)記在活體組織中的分布規(guī)律及對(duì)受損組織是否有優(yōu)勢(shì)分布的現(xiàn)象。
　　3.化療損傷的小鼠模型24只，由腹腔注射CTX得到，隨機(jī)將小鼠分為治療組和對(duì)照組，每組12只。將體外分離培養(yǎng)得到的ADSCs經(jīng)尾靜脈注射到治療組小鼠模

6、型體內(nèi)，對(duì)照組注射相同成分的等體積的培養(yǎng)液作對(duì)照。兩組小鼠每小組3只，分成4個(gè)小組，分別于第3、7、10、14天處死各組小鼠，取小鼠肺、食管、脾臟、腎臟、小腸進(jìn)行石蠟切片，取小鼠胸腺進(jìn)行冰凍切片，HE染色后，觀察不同時(shí)段各組相應(yīng)臟器損傷的修復(fù)情況。
　　結(jié)果：
　　1.體外分離、培養(yǎng)小鼠ADSCs并成功傳代培養(yǎng)后，用pAdxsi-EGFP轉(zhuǎn)染ADSCs，12小時(shí)后即可見熒光表達(dá)，隨著時(shí)間的推移熒光表達(dá)逐漸增強(qiáng)。48小時(shí)觀察熒

7、光表達(dá)趨于穩(wěn)定，熒光表達(dá)隨病毒稀釋液濃度增加而增加，當(dāng)MOI為100時(shí)，熒光表達(dá)率最高，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光轉(zhuǎn)染率為80％，且細(xì)胞形態(tài)正常，未見細(xì)胞變形、脫落等情況，表示細(xì)胞未受損。以MOI為100的病毒轉(zhuǎn)染ADSCs，同未轉(zhuǎn)染的ADSCs一同應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，描繪生長曲線，結(jié)果顯示病毒轉(zhuǎn)染后的ADSCs增殖活性未受影響。
　　2.6只小鼠在成功尾靜脈注射后正常存活，于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過小動(dòng)物活體成像儀觀察對(duì)照組3只及實(shí)驗(yàn)組

8、(注射CTX組)3只均未見有熒光聚集表現(xiàn)。無法在體外追蹤到熒光細(xì)胞去向。
　　3.胸腺組織在化療后第3天即有明顯損傷，皮髓質(zhì)界限開始模糊，皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞開始出現(xiàn)變性，細(xì)胞開始溶解壞死，髓質(zhì)區(qū)胸腺小體減少。而此后各時(shí)間點(diǎn)組織修復(fù)程度相比較，對(duì)照組胸腺組織在第10天時(shí)細(xì)胞數(shù)量開始逐漸增多，說明修復(fù)的發(fā)生，而治療組在第7天時(shí)細(xì)胞壞死程度即低于對(duì)照組，且此后細(xì)胞數(shù)量明顯增多，說明治療組胸腺的修復(fù)速度要更快，ADSCs可以修復(fù)化療損傷的胸腺

9、。
　　脾臟在化療后第3天治療組及對(duì)照組均出現(xiàn)脾小結(jié)結(jié)構(gòu)不清晰，脾臟白髓和紅髓邊界模糊，細(xì)胞數(shù)量減少。但繼續(xù)觀察，對(duì)照組在14天，細(xì)胞數(shù)量開始逐漸增多，說明脾臟的自我修復(fù)開始，而治療組脾臟在第10天損傷較前已經(jīng)改善，第14天時(shí)白髓和紅髓的界線已經(jīng)可以辨別，細(xì)胞的數(shù)量也基本恢復(fù)。說明ADSCs對(duì)脾臟有明顯的修復(fù)作用。
　　食管在化療后第3天，對(duì)照組和治療組均可見上皮層的連續(xù)完整性被破壞，基底細(xì)胞層可見液化，對(duì)照組在第14天時(shí)，

10、基底細(xì)胞層液化細(xì)胞開始減少，但仍然存在。治療組在第7天，基底細(xì)胞層液化細(xì)胞數(shù)量就已經(jīng)明顯減少，第14天時(shí)已基本恢復(fù)正常。說明ADSCs對(duì)化療損傷的食管有明顯的修復(fù)作用。
　　腎臟在化療后第3天損傷即可出現(xiàn)。皮質(zhì)和髓質(zhì)邊界不清晰，組織結(jié)構(gòu)雜亂無序，部分腎小球細(xì)胞變性腫脹，腎小球囊變得不明顯，腎小管輪廓不清，腎小管上皮細(xì)胞邊界不清，細(xì)胞濁腫明顯，管間排列紊亂，管腔擴(kuò)張或閉合。對(duì)照組腎臟隨著時(shí)間推移損傷程度并無明顯加重，第14天細(xì)胞水腫

11、情況有所改善?；熀蟮?天治療組和對(duì)照組腎臟損傷程度無差別，第10天時(shí)，治療組在鏡下觀察細(xì)胞腫脹稍有緩解，提示已有所修復(fù)，而對(duì)照組尚不明顯。第14天時(shí)治療組腎小管輪廓較前清晰，而對(duì)照組尚未能見到清晰腎小管輪廓。說明給予ADSCs治療的小鼠腎臟比對(duì)照組腎臟修復(fù)速度快，ADSCs對(duì)化療損傷腎臟有一定修復(fù)作用。
　　小腸的對(duì)照組化療后第3天多見小腸絨毛變短或不規(guī)則，部分微絨毛脫落，隨著時(shí)間的推移損傷沒有進(jìn)一步加重?；熀笮∧c各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的

12、病理變化，治療組同對(duì)照組無明顯區(qū)別。ADSCs對(duì)化療損傷的小腸組織的修復(fù)作用尚未證實(shí)。
　　肺組織在化療后無明顯損傷。
　　結(jié)論：
　　1.PAdxsi-EGFP可以高效、安全的轉(zhuǎn)染ADSCs，但是對(duì)照組及觀察組均未見有熒光聚集現(xiàn)象，無法在體外追蹤到熒光細(xì)胞去向。
　　2.ADSCs對(duì)化療損傷的胸腺、食管、脾臟、腎臟均具有不同程度的修復(fù)作用，對(duì)損傷較重的器官如胸腺、脾臟、食管的修復(fù)作用更為明顯，腎臟次之，對(duì)小腸損