腺病毒介導hTRX修飾的間充質(zhì)干細胞在小鼠急性放射損傷中的修復作用研究.pdf

1、急性放射損傷的防治一直是各國重點開展研究的領域。目前造血干細胞移植和造血生長因子的應用仍是治療極重度骨髓型急性放射病的主要措施,但作用有限。因此,急需尋找新的預防或治療方法。硫氧還蛋白(TRX)具有清除自由基、抑制凋亡和促細胞生長等多重生物學作用,而間充質(zhì)干細胞(MSC)易于外源基因轉染和表達,且具有向照射后受損組織聚集的生物學特性。為此我們觀察了腺病毒介導hTRX修飾的人臍帶間充質(zhì)干細胞(hucMSC)在急性放射損傷的NOD/SCID

2、小鼠中的修復作用。為基因修飾的MSC治療急性輻射相關性損傷提供了實驗依據(jù)。經(jīng)過相關文獻的檢索,目前尚未見國內(nèi)外有相關研究的報道。
　　第一,我們采用骨片消化結合細胞貼壁法培養(yǎng)小鼠骨實質(zhì)MSC;采用膠原酶消化法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞(hucMSC),顯微鏡下觀察細胞形態(tài),細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線,采用流式細胞儀檢測細胞周期及細胞表型,采用油紅染色鑒定成脂誘導情況;阿爾辛藍及甲苯胺藍染色檢測成軟骨細胞誘導情況;堿性磷酸酶染色及Von

3、Kossa染色檢測成骨細胞誘導情況。結果表明,分離、擴增培養(yǎng)的MSC細胞形態(tài)均一,其中小鼠骨實質(zhì)MSC高表達Sca-1、CD29和CD44,而不表達CD11b、CD117、CD34和CD45;hucMSC細胞高表達HLA-I、CD105、CD166、CD73及CD90,不表達CD31、CD14、CD34、CD45、CD80、CD86及HLA-DR,符合MSC的表型特點。細胞周期檢測顯示,90％以上的細胞處于G0/G1期。在特定誘導條件下

4、,兩種MSC細胞均可向成骨、成軟骨及脂肪細胞分化。
　　第二,我們以hTRX為目的基因,設計含有NotI和EcoRV酶切位點的引物,PCR擴增hTRX基因全長序列,將擴增產(chǎn)物連接到帶有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)標記的pDC316-mCMV穿梭質(zhì)粒上,構建重組穿梭質(zhì)粒pDC316-hTRX-EGFP,同時選用不含目的基因的空腺病毒質(zhì)粒pAd316-EGFP作為對照。利用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉染的方法將AdMa

5、x腺病毒包裝系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭質(zhì)粒pDC316-hTRX-EGFP共轉染入HEK293細胞,進行同源重組,得到腺病毒重組質(zhì)粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包裝擴增病毒,將獲得的病毒用氯化銫高速梯度離心、純化病毒,測定病毒顆粒數(shù)及滴度。采用PCR方法對重組腺病毒進行鑒定。結果顯示,重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PCR和NotI、EcoRV酶切鑒定,證實含有hTRX基因,測序結果和TRX的理論序列一致。成功制備了純度

6、較高的病毒液,其中Ad-hTRX-EGFP病毒滴度達5.558×1010pfu/ml,對照病毒Ad-EGFP病毒滴度達3.1×1010pfu/ml。
　　第三,根據(jù)不同梯度的感染復數(shù)(MOI),我們檢測了重組腺病毒載體Ad-EGFP對小鼠骨實質(zhì)MSC的感染效率以及重組腺病毒載體Ad-hTRX-EGFP對293細胞和hucMSC的感染效率,用RealTimePCR檢測了細胞內(nèi)hTRX基因mRNA表達,采用Westernblot檢測了

7、細胞內(nèi)hTRX蛋白的表達。并探討了感染hTRX基因?qū)ucMSC細胞周期及分化特性的影響。結果顯示,隨著MOI值的升高,感染效率逐漸提高,當MOI=250時,Ad-EGFP對小鼠MSC的感染效率為46.78%;而當MOI=100時,Ad-hTRX-EGFP對293細胞和hucMSC的感染效率分別為92.5%和95.22%。Westernblot檢測顯示,感染后的293細胞和hucMSC細胞內(nèi)hTRX蛋白量增高,hucMSC細胞內(nèi)hTRX

8、基因mRNA水平升高了10.52±3.21倍(P<0.05)。病毒感染后的hucMSC細胞周期顯示,93.2%的細胞處于G0/G1期。在特定誘導條件下,感染后的hucMSC細胞可向軟骨及脂肪細胞分化。說明感染hTRX對hucMSC的細胞周期及分化沒有影響。
　　最后,我們評價了hTRX修飾的人臍帶間充質(zhì)干細胞在NOD/SCID小鼠急性放射損傷中的修復作用。將hTRX修飾的hucMSC通過尾靜脈輸注給經(jīng)4.5Gy全身照射的NOD/S

9、CID小鼠體內(nèi),并設置hucMSC治療組和單純照射組。通過觀察小鼠一般狀況和生存時間,檢測血常規(guī)、骨髓Lin-CD117+細胞比例和組織病理來評價治療效果。結果顯示,照射后第7天、第11天、第20天及第30天hTRX-hucMSC組小鼠的紅細胞及血紅蛋白顯著高于單純照射組和hucMSC組小鼠,其中第11天及第30天,hTRX-hucMSC組與其他兩組均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05);而第7天及第20天僅hTRX-hucMSC組與單純照射

10、組存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。雖然第7天、第20天及第30天hucMSC組小鼠的紅細胞及血紅蛋白也高于單純照射組,但二者之間無統(tǒng)計學差異。+30天hTRX-hucMSC組小鼠骨髓Lin-CD117+細胞比例明顯高于其他兩組,且均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。各組小鼠照射30天組織病理顯示,肝、脾和腸病理改變相對較輕微,而骨髓及肺臟病理改變顯著。單純照射組肝細胞輕度水腫,肝動脈及門靜脈充血,可見膽栓形成;脾臟可見血管充血及大量炎細胞

11、浸潤。hucMSC組和hTRX-hucMSC組肝脾病理表現(xiàn)較單純照射組略減輕。腸粘膜病理各組無明顯差異。單純照射組小鼠肺泡壁顯著增寬,血管顯著充血,出血,間質(zhì)水腫,透明膜形成,炎細胞浸潤顯著。hucMSC組小鼠肺泡壁增寬,血管充血,中等量炎細胞浸潤。而hTRX-hucMSC組小鼠肺泡壁間隔正常,少許血管充血,少量炎細胞浸潤。提示hTRX-hucMSC組小鼠肺損傷比其他兩組小鼠明顯減輕。單純照射組小鼠骨髓組織增生極度減低;hucMSC組小

12、鼠骨髓組織增生輕度減低;而hTRX-hucMSC組小鼠骨髓增生活躍。各組生存時間顯示,單純照射組小鼠生存時間為26±14.43d;hucMSC組為29.33±14.49d,生存時間較空白組延長,但無統(tǒng)計學差異(P=0.36),而hTRX-hucMSC組小鼠為56.67±5.25d。生存時間較前兩組顯著延長(P<0.01)。以上結果說明,hTRX通過保護了殘存的造血干細胞,特別是促進紅細胞及血紅蛋白生成,來保證重要組織臟器的氧供應。此外,