喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶急性損傷修復(fù)中作用的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、隨著嗓音外科學(xué)的不斷發(fā)展,嗓音外科醫(yī)生可在顯微鏡下通過激光等方法切除聲帶不良病變,但術(shù)中易造成聲帶固有層損傷,導(dǎo)致固有層細(xì)胞外基質(zhì)成分的含量及分布發(fā)生改變從而形成瘢痕。如何減少瘢痕的形成,一直是困擾研究人員的重要問題。既往有學(xué)者通過在動物聲帶內(nèi)注射各種干細(xì)胞,如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪基質(zhì)干細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞等修復(fù)聲帶損傷,然而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取材時患者較為痛苦,不宜反復(fù)取材,脂肪基質(zhì)干細(xì)胞雖易取材,但其組織來源與聲帶組織結(jié)構(gòu)差異大,胚胎干

2、細(xì)胞的應(yīng)用仍存在倫理方面的問題等,因此限制了這些細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用。
  近年來研究人員已證實在高等動物體內(nèi)廣泛存在著間充質(zhì)干細(xì)胞,喉黏膜因其范圍廣,取材相對方便,且此部位細(xì)胞的組織來源與聲帶組織結(jié)構(gòu)最為接近,不存在倫理方面的問題,因此我們設(shè)想喉黏膜中是否同樣存在間充質(zhì)干細(xì)胞。若能成功分離此種細(xì)胞,并將其用于喉部組織的缺損修復(fù),將會為聲帶損傷的患者帶來新的希望。因此前期實驗中劉陽已成功從人喉黏膜中培養(yǎng)出具有快速增殖能力及多向分化潛

3、能的間充質(zhì)干細(xì)胞,命名為喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(LM-MSCs)。本實驗的研究目的是將LM-MSCs應(yīng)用于動物實驗,觀察LM-MSCs在受損聲帶內(nèi)的存活情況及轉(zhuǎn)歸,并在形態(tài)及組織學(xué)水平觀察其對聲帶損傷的修復(fù)作用。
  1、目的:
  探討犬喉黏膜中是否存在間充質(zhì)干細(xì)胞,對其進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定,將其植入犬受損聲帶,觀察LM-MSCs在聲帶內(nèi)的存活及轉(zhuǎn)歸,并評估其對聲帶損傷的修復(fù)作用。
  2、方法:
  2.1、犬喉黏

4、膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
  犬處死后取材,獲取正常會厭舌側(cè)黏膜,利用消化培養(yǎng)法獲得黏膜固有層細(xì)胞,利用成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)液對其多向分化的能力進(jìn)行研究,通過MTT實驗、平板克隆形成試驗觀察LM-MSCs的生物學(xué)特性及通過流式細(xì)胞儀對LM-MSCs表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測分析。
  2.2、犬聲帶激光損傷模型的建立
  中華田園犬5只,其中4只在支撐喉鏡下挑起會厭顯露雙側(cè)聲帶,局部噴少量利多卡因,半導(dǎo)體激光雙側(cè)對稱性

5、切除聲帶膜部中后1/3處,深度達(dá)甲杓肌,雙側(cè)對稱,1只犬未損傷作為對照組。術(shù)后觀察雙側(cè)聲帶的大體愈合情況,如充血、水腫、損傷表面的不規(guī)則性,有無萎縮及瘢痕形成。分別于術(shù)后4d、2w、4w及8w聲帶取材,左側(cè)聲帶行石蠟切片(厚度約5μm),HE染色觀察聲帶損傷處炎性細(xì)胞侵潤及纖維組織增生情況,Masson trichrome染色、Elastin VG染色、Alcian blue染色分別觀察膠原纖維、彈力纖維、透明質(zhì)酸的分布與含量變化,右側(cè)

6、聲帶行冰凍切片(厚度約5μm)并行纖維連接蛋白(Fibronectin)免疫組化染色觀察fibronectin的含量變化。
  2.3、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶急性損傷修復(fù)中作用的實驗研究
  2.3.1、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞對聲帶大體愈合情況的影響
  取第3代LM-MSCs,Dil熒光染料標(biāo)記后備用,中華田園犬10只,支撐喉鏡下半導(dǎo)體激光損傷雙側(cè)聲帶膜部中后1/3,深度達(dá)甲杓肌,損傷后即行聲帶注射術(shù),左側(cè)聲帶注射0.

7、2ml LM-MSCs與膠原的混合物(約含2×106個細(xì)胞)作為干細(xì)胞組,右側(cè)聲帶僅注射0.2ml膠原作為對照組。對10只犬隨機(jī)分組,1-6號犬分別于術(shù)后2w、4w及8w在支撐喉鏡下觀察受損聲帶愈合的情況,如充血、水腫、損傷表面的不規(guī)則性,有無萎縮及瘢痕形成。
  2.3.2、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞對聲帶固有層結(jié)構(gòu)的影響
  將犬處死取材,行冰凍切片后,并行免疫組化染色觀察fibronectin的含量變化,石蠟切片HE染色觀察聲

8、帶固有層炎性細(xì)胞侵潤及纖維組織增生情況,并行Masson trichrome染色、EVG染色、Alcian blue染色觀察聲帶固有層中膠原纖維、彈力纖維及透明質(zhì)酸(HA)的排列及含量改變。
  2.3.3、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶內(nèi)存活的情況
  1-6號犬聲帶行冰凍切片后,用Hochest熒光染料襯染聲帶組織細(xì)胞核15min,PBS沖洗切片,熒光顯微鏡下觀察植入的LM-MSCs在聲帶內(nèi)存活及分布的情況,觀察植入的LM-M

9、SCs隨時間的推移存活數(shù)量的變化。
  2.3.4、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶內(nèi)的轉(zhuǎn)歸
  術(shù)后4w及8w分別處死2只犬(7-10號)觀察干細(xì)胞在聲帶內(nèi)的轉(zhuǎn)歸,冰凍切片后行免疫熒光Vimentin染色及Smooth musle actin染色,二抗帶FITC熒光,熒光顯微鏡下觀察植入的LM-MSCs在聲帶組織中轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞的能力,植入的LM-MSCs本身呈紅色熒光,若在藍(lán)光的激發(fā)下同時可呈綠色熒光,證明其可轉(zhuǎn)

10、化為成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞。
  3、結(jié)果:
  3.1、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
  原代培養(yǎng)的LM-MSCs在3d左右貼壁生長,起初成短梭狀,隨后細(xì)胞伸展?jié)u成長梭狀,與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似,胞核大。在體外分別經(jīng)成脂、成骨和成軟骨誘導(dǎo)分化后,油紅O染色陽性,茜素紅染色陽性,成軟骨微團(tuán)II型膠原免疫組化染色DAB顯色可觀察到陽性信號。培養(yǎng)的LM-MSCs增殖能力強(qiáng),增殖過程中無停滯期,接種后第3d開始處于對數(shù)

11、生長期,第7d達(dá)到生長峰值,第8d進(jìn)入生長平臺期。平板克隆形成試驗結(jié)果示LM-MSCs有較高的克隆形成率約19.7%。通過流式細(xì)胞儀對LM-MSCs進(jìn)行表面標(biāo)志物的分析,LM-MSCs高表達(dá)間充質(zhì)的表面分子標(biāo)志(CD29-77.6%、CD44-75.5%、CD90-97.3%、CD105-38.3%),不表達(dá)造血系的表面分子標(biāo)志(CD34-1.8%、CD45-0.9%)。
  3.2、犬聲帶激光損傷模型的建立
  術(shù)后4d支

12、撐喉鏡下雙側(cè)聲帶充血、水腫,肉芽組織形成,表面不規(guī)則,組織切片HE染色示上皮未被覆固有層,損傷處可見大量炎性細(xì)胞侵潤,固有層與聲帶肌層界限不清,各種ECM成分不易檢出。術(shù)后2w喉鏡下見聲帶充血較前減輕,但仍有水腫,受損表面不規(guī)則,HE染色示新生上皮被覆受損部位,炎性細(xì)胞數(shù)量較前減少,大量纖維組織增生;ECM改變(根據(jù)切片IOD值檢測):fibronectin含量增加,膠原纖維增粗含量增加,排列紊亂,彈力纖維含量減少且變細(xì),排列不齊,HA

13、含量下降。術(shù)后4w喉鏡可見雙側(cè)聲帶充血水腫基本消失,受損處表面不規(guī)則,萎縮形成,HE染色示固有層無炎性細(xì)胞侵潤,且被致密的纖維組織所替代;ECM改變:fibronectin含量持續(xù)增加,膠原含量增加,排列紊亂,彈力纖維含量略下降,且排列不齊,HA含量下降。術(shù)后8w喉鏡可見雙側(cè)聲帶無明顯充血水腫,損傷表面不規(guī)則,局部萎縮,瘢痕修復(fù);ECM改變:fibronectin含量略上升,膠原纖維呈粗大條索狀,含量增加排且列紊亂,彈力纖維含量趨于穩(wěn)定

14、,HA含量下降。
  3.3、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶急性損傷修復(fù)中作用的實驗研究
  3.3.1、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞對聲帶大體愈合情況的影響
  術(shù)后2w可觀察到雙側(cè)聲帶水腫,稍充血,表面不規(guī)則,且有肉芽形成,干細(xì)胞組聲帶肉芽形成較少,且聲帶表面較對照組規(guī)則;術(shù)后4w時雙側(cè)聲帶充血、水腫基本消失,表面稍不規(guī)則,肉芽組織不明顯,萎縮形成,對照組聲帶表面不規(guī)則性及萎縮較干細(xì)胞組明顯;術(shù)后8w時雙側(cè)聲帶無充血、水腫,無新生

15、肉芽組織形成,聲帶損傷局部可見萎縮、瘢痕形成,對照組聲帶瘢痕較干細(xì)胞組大,且萎縮明顯。
  3.3.2、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞對聲帶固有層結(jié)構(gòu)的影響
  犬處死后聲帶取材并行組織切片觀察,2w時干細(xì)胞組聲帶固有層內(nèi)炎性細(xì)胞侵潤及纖維組織增生要小于對照組;雙側(cè)聲帶fibronectin含量持續(xù)上升,干細(xì)胞組含量略低于對照組;雙側(cè)聲帶膠原含量增加,干細(xì)胞組的膠原纖維含量稍低于對照組,且排列上較對照組規(guī)則;雙側(cè)聲帶彈力纖維含量均減少,

16、排列紊亂,干細(xì)胞組含量高于對照組;HA含量呈下降趨勢,干細(xì)胞組含量略高于對照組。4w時雙側(cè)聲帶炎性細(xì)胞侵潤基本消失,纖維組織增生,干細(xì)胞組增生小于對照組;雙側(cè)聲帶fibronectin上升,干細(xì)胞組含量低于對照組;膠原纖維呈條索狀,含量持續(xù)增加,干細(xì)胞組較對照組含量低,排列較規(guī)則;彈力纖維含量繼續(xù)下降,纖維直徑變細(xì),干細(xì)胞組含量稍高于對照組;HA含量下降,干細(xì)胞組含量略高于對照組。8w時雙側(cè)聲帶觀察不到炎性細(xì)胞侵潤,纖維組織增生明顯;雙

17、側(cè)聲帶fibronectin上升,對照組含量高于干細(xì)胞組;雙側(cè)聲帶膠原呈粗大條索狀,含量增加,對照組較干細(xì)胞組排列紊亂;彈力纖維含量趨于穩(wěn)定,干細(xì)胞組彈力纖維直徑較對照組粗。HA含量持續(xù)降低,干細(xì)胞組含量高于對照組。
  3.3.3、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶內(nèi)的存活情況
  干細(xì)胞注射術(shù)后2w、4w及8w熒光顯微鏡下觀察到植入的LM-MSCs在聲帶固有層內(nèi)存活,2w時固有層內(nèi)有大量紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞,提示此時有較多數(shù)量的移植

18、細(xì)胞存活,4w時植入的LM-MSCs存活數(shù)量較2w時明顯減少,8w時仍可觀察到存活的LM-MSCs,但數(shù)量較前明顯減少。
  3.3.4、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在聲帶內(nèi)的轉(zhuǎn)歸
  Vimentin免疫熒光染色,4w時熒光顯微鏡下一些呈紅色熒光的LM-MSCs在藍(lán)光的激發(fā)下同時可發(fā)出綠色熒光,提示植入的LM-MSCs可轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞,同樣的方法,8w時也可觀察到一些植入的LM-MSCs轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞。Smoothmucleac

19、tin免疫熒光染色,熒光顯微鏡下可見4w時植入的LM-MSCs在藍(lán)光的激發(fā)下同時可發(fā)出綠色熒光,提示植入的LM-MSCs可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,同樣的方法,8w時未能觀察到植入的LM-MSCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。
  4、結(jié)論:
  4.1、本實驗利用消化培養(yǎng)法成功培養(yǎng)并鑒定了犬喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞,證明了其具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化的能力。犬喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有有較快的生長增殖速度和較高的克隆形成能力,表達(dá)間充質(zhì)

20、干細(xì)胞表面標(biāo)志物。
  4.2、支撐喉鏡下應(yīng)用半導(dǎo)體激光造成犬聲帶膜部損傷,術(shù)后喉鏡下可見2w時雙側(cè)聲帶充血水腫,4w時出現(xiàn)萎縮,8w時瘢痕形成,組織學(xué)示固有層內(nèi)膠原含量持續(xù)上升,排列紊亂,提示大量瘢痕組織形成,彈力纖維含量下降示聲帶組織的彈性下降,HA含量降低示聲帶振動能力及抑制膠原無序沉積的能力下降,fibronectin含量增加示組織纖維化程度加重,以上結(jié)果表明本實驗成功的建立了犬聲帶損傷模型,為后續(xù)損傷修復(fù)實驗提供了可靠的

21、動物模型。
  4.3.1、喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞聲帶植入后,充血水腫較對照組輕。干細(xì)胞組聲帶表面較對照組規(guī)則,萎縮程度小,瘢痕形成少。
  4.3.2、組織切片示喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞能降低固有層中膠原的沉積及無序排列,提高彈力纖維與HA含量以保證聲帶的有效振動,且具有抑制fibronectin含量上升以減少固有層纖維化的功能,以上結(jié)果表明喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成,改變微環(huán)境修復(fù)聲帶損傷。
  4.3

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