小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)硬皮病治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的： 系統(tǒng)性硬皮病(systemicscleroderma，SSc)是一種以局限性或彌漫性皮膚及內(nèi)臟器官的纖維化為特征的結(jié)締組織病。目前其確切病因及發(fā)病機(jī)制仍未明確，亦無切實(shí)有效的治療手段，探討本病的發(fā)病機(jī)理，尋找有效的治療藥物和方法有非常重要的意義。 SSc是一種自身免疫性疾病，以皮膚和組織器官纖維化、硬化為特征，其在早期病變時(shí)，患者已有顯著的細(xì)胞免疫和體液免疫異常：包括T淋巴細(xì)胞亞群的分布異常，局部單核細(xì)

2、胞浸潤，多種自身抗體的產(chǎn)生等。而膠原合成過多，分解減少，大量膠原纖維在皮膚、肺、腎、消化道等組織器官的沉積是其主要病理過程之一。人體合成膠原的最主要場(chǎng)所是成纖維細(xì)胞，有研究顯示，體外培養(yǎng)的SSc病人成纖維細(xì)胞合成I、III型膠原纖維的量明顯增加；SSc患者成纖維細(xì)胞電鏡超微結(jié)構(gòu)存在異常，被認(rèn)為是研究SSc細(xì)胞外基質(zhì)、膠原形成機(jī)制的良好體外模型。此外，國內(nèi)外研究顯示，多種細(xì)胞因子參與了膠原成分表達(dá)的調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(trans

3、forminggrowthfacto-beta，TGF-β)在組織纖維化產(chǎn)生的病理機(jī)制中起到最為重要的作用。此外，血管病變和遺傳、環(huán)境因素也被認(rèn)為參與了SSc的發(fā)病機(jī)制。 干細(xì)胞是具有很強(qiáng)自身增殖能力及向各種類型細(xì)胞分化能力的始祖細(xì)胞。 近年，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell，MSC)由于具備較高的增殖能力、免疫調(diào)節(jié)活性和低免疫原性而備受關(guān)注，為治療多種疾病提供了新的線索，并且避免了胚胎干細(xì)胞研究的倫

4、理學(xué)問題，臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)突出。MSC具有以下的生物學(xué)特性：1、潛在的抗增殖作用和免疫調(diào)節(jié)活性。體外研究發(fā)現(xiàn)，由同種異體刺激引起的混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)體系中加入MSC，幾乎使T細(xì)胞增殖被完全抑制。在小鼠模型，MSC通過阻斷抗原激活的T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的S期而抑制T細(xì)胞的分化；在體外，MSC亦有抑制B細(xì)胞增殖的作用，尤其在B細(xì)胞與MSC的比例為1:1時(shí)，這種作用表現(xiàn)得最強(qiáng)；除了對(duì)T、B細(xì)胞的抑制作用外，MSC也可抑制單核細(xì)胞分化成樹突樣細(xì)胞(

5、dendriticcells，DCs)。MSC的免疫調(diào)節(jié)活性存在劑量依賴性，非MHC限制性，免疫調(diào)節(jié)的可逆性等特點(diǎn)；2、多向分化潛能，促進(jìn)組織的修復(fù)。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，MSC在適宜微環(huán)境下可分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、心肌、上皮細(xì)胞等，并且MSC能逃避免疫監(jiān)視，在同種異基因、異種異基因或同種同基因的環(huán)境中長期存活，在移植后仍能保持它的多向分化潛能，從而成為組織工程學(xué)的重要種子細(xì)胞；3、多器官歸巢能力和可塑性。4、促進(jìn)造血植入。目前已在

6、骨髓、肝、脾、肺、肌肉、腦、真皮組織中證實(shí)有MSC的存在，而皮膚作為人體最大的組織器官，可提供大量的種子細(xì)胞，且取材方便，故選擇真皮MSC作為研究的種子細(xì)胞具有更廣闊的應(yīng)用前景。 以往針對(duì)SSc免疫系統(tǒng)紊亂和纖維化病變的治療主要集中在免疫抑制劑和抗纖維化藥物如D-青霉胺，秋水仙堿等，但副作用大且收效甚微。隨著干細(xì)胞研究的深入，其在治療其他醫(yī)學(xué)頑癥上取得了斐然的成績(jī)。大量的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)MSC局部輸注或系統(tǒng)輸注均可通過分泌各種黏附分

7、子和細(xì)胞因子，整合到局部組織或分布全身各器官，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)的作用，在神經(jīng)系統(tǒng)、心肌梗死等方面研究較多，對(duì)于膠原相關(guān)的關(guān)節(jié)炎，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也已進(jìn)行了初步的研究，但對(duì)于與自身免疫和膠原相關(guān)的硬皮病的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。 由于MSC在不同的自身免疫性疾病治療中可能通過不同的作用機(jī)制發(fā)揮著不同的免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)作用，故本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平探討MSC對(duì)硬皮病的體外模型--硬皮病成纖維細(xì)胞(humanfibrobla

8、stofsclerodermapatient，hsFb)和體內(nèi)模型--硬皮病小鼠模型的作用以及其中的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用MSC治療硬皮病提供理論依據(jù)。 材料和方法： 1.小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞(Mousedermis-derivedMSCs，mdMSCs)的分離、培養(yǎng)和鑒定 1.1mdMSCs的分離、培養(yǎng) 取出生1天BALB/C小鼠，胰酶消化，培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，常規(guī)傳代，分別凍存。 1.2mdMSCs的

9、鑒定 觀察培養(yǎng)所得細(xì)胞形態(tài)，繪制生長曲線，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和表面標(biāo)志、細(xì)胞純度。 1.3mdMSCs的標(biāo)記 CM-DiI熒光標(biāo)記分離、純化的mdMSCs。 2.mdMSCs對(duì)硬皮病成纖維細(xì)胞(humanfibroblastofsclerodermapatient，hsFb)的作用 2.1分離、體外培養(yǎng)hsFb、正常人皮膚成纖維細(xì)胞(normalhumanskinfibroblast，hnFb

10、). 2.2將mdMSCs分別與hsFb/hnFb建立Transwell共培養(yǎng)體系，ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)體系上清夜中TGF-β1、膠原含量(羥脯氨酸Hyp)的變化。 3.硬皮病動(dòng)物模型的制備 博來霉素連續(xù)皮下注射BALB/C小鼠，每日1次，共3周，取皮膚活檢，證實(shí)造模成功。 4.局部皮損內(nèi)輸注mdMSCs對(duì)硬皮病皮損的作用 4.1選擇不同細(xì)胞密度梯度的mdMSCs局部皮損內(nèi)輸注予硬皮病小鼠模型。

11、 4.2激光共聚焦顯微鏡顯示CM-DiI標(biāo)記mdMSCs硬皮病小鼠模型皮損內(nèi)輸注后在局部皮膚內(nèi)的遷移。 4.3輸注前、后皮損的變化 比較輸注前后皮膚組織Masson染色顯示皮膚膠原含量的變化，初步了解mdMSCs)對(duì)硬皮病小鼠皮損的作用。 結(jié)果： 1.mdMSCs分離培養(yǎng)第三代細(xì)胞中CD44+CD29+，CD80-CD45-細(xì)胞純度為92.00％，CM-DiI標(biāo)記mdMSCs熒光明亮清晰，細(xì)胞密度

12、、大小與光鏡下所見基本一致。 2.單獨(dú)培養(yǎng)的hsFb和hnFb上清液Hyp含量在第4天無明顯差異，第8天hsFb的Hyp分泌量較hnFb高，差異有顯著性(p<0.05)。 3.mdMSCs2.5×104和mdMSCs1×104與hnFb共培養(yǎng)第8天上清液中Hpy含量較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而經(jīng)各細(xì)胞密度mdMSCs處理的hsFb培養(yǎng)上清液中Hpy含量與單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)無顯著性差異。 4.

13、單獨(dú)培養(yǎng)的hsFb和hnFb上清液TGF-β1的含量在第4天時(shí)無明顯差異，第8天hsFb的TGF-β1分泌量較hnFb高，差異有顯著性(p<0.05)。 5.經(jīng)mdMSCs2.5×104處理的hsFb培養(yǎng)組，在共培養(yǎng)第4天其上清液中TGF-β1含量較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，至共培養(yǎng)第8天時(shí)與單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)比較無差異(p>0.05)。經(jīng)mdMSCs處理的各組hnFb培養(yǎng)上清液中TGF-β1含量于共培養(yǎng)第8

14、天時(shí)均高于單獨(dú)培養(yǎng)，差異有非常顯著性(p<0.01)：經(jīng)mdMSCs1×104處理的hnFb培養(yǎng)上清液中TGF-β1含量在第4亦高于單獨(dú)培養(yǎng)，差異有顯著性(p<0.05)。 6.不同細(xì)胞密度的MSC處理組的Hyp含量與TGF-β1水平無相關(guān)關(guān)系(r=0.221，p>0.05)；而未經(jīng)MSC處理的單獨(dú)培養(yǎng)hsFb與hnFb組其培養(yǎng)上清液Hyp含量與TGF-β1水平有正相關(guān)關(guān)系(r=0.682，p<0.01)。 7.BALB

15、/C小鼠背部皮下連續(xù)注射博來霉素3周后成功誘導(dǎo)伴皮膚和肺部損害的硬皮病小鼠模型。 8.硬皮病小鼠模型皮膚內(nèi)輸注CM-DiI標(biāo)記mdMSCs后可向表皮和真皮深部、毛囊處遷移。 9.mdMSCs1×107局部皮損內(nèi)輸注硬皮病小鼠模型后的第2和第3周，皮損區(qū)皮膚Masson染色膠原纖維組織化學(xué)指數(shù)均較未處理組低，差異有顯著性(P<0.05)。 結(jié)論： 1.組織消化-細(xì)胞貼壁-傳代培養(yǎng)法能有效培養(yǎng)小鼠真皮MSCs