氧化苦參堿對高脂誘導的HepG2細胞胰島素抵抗和脂代謝影響的研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代生活水平的提高，肥胖的發(fā)病率日趨增加，而胰島素抵抗（insulinresistance,IR）作為肥胖、2型糖尿病、高脂血癥、非酒精性脂肪肝等多種代謝性疾病的共同病理生理基礎(chǔ)，已成為近年來的研究熱點。氧化苦參堿是從中藥苦參中提取的一種單體成分，既往研究表明氧化苦參堿具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學功能，近來研究表明氧化苦參堿與二甲雙胍聯(lián)合治療可顯著改善NAFLD患者的肝功能，明顯減輕肝臟脂質(zhì)沉積，增強其胰島素敏感

2、性，但具體機制尚不明確。
　　本研究擬在體外細胞水平，通過觀察氧化苦參堿對高脂誘導的HepG2細胞IR和脂代謝的影響，探討其改善IR和脂代謝的分子機制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。
　　目的：觀察中藥制劑氧化苦參堿對高脂誘導的HepG2細胞IR和脂質(zhì)沉積的影響，從胰島素信號傳導、脂代謝及氧化應激方面探討其分子機制。
　　方法：采用高脂（含0.25mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)基）誘導法建立HepG2細胞的胰島素抵抗模型。將HepG

3、2細胞隨機分為正常對照組和高脂干預組，分別干預24小時后，利用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，并計算葡萄糖消耗率，判定造模是否成功。造模成功后將高脂干預組隨機分為5組，分別為高脂組（Pa）、二甲雙胍組（Met）（二甲雙胍濃度0.20mg/mL）、氧化苦參堿低劑量組（Omt-L）（氧化苦參堿濃度為0.04mg/mL）、氧化苦參堿中劑量組（Omt-M）（氧化苦參堿濃度為0.08mg/mL）和氧化苦參堿高劑量組（Omt-H）（氧化苦參

4、堿濃度為0.16mg/mL），同時設(shè)立正常對照組（N）。分別干預48小時后收集細胞，采用相應試劑盒測定各組HepG2細胞內(nèi)甘油三酯含量及氧化應激相關(guān)指標，即谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）的活性及丙二醛（MDA）的含量；DCFH-DA（2,7-dichlorofuorescindiacetate）熒光染色檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）的含量；油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積程度；Real-TimePCR檢測He

5、pG2細胞胰島素信號通路上INSR、IRS-1、Akt及GLUT4與脂代謝通路上SREBP-1c、FAS、ACC、SCD-1、CPT-1及CD36的mRNA表達水平；WesternBlot檢測HepG2細胞GLUT4、CD36、FAS、ACC及SCD-1蛋白的表達水平，以及IRS-1和Akt的總蛋白及磷酸化蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1、HepG2細胞IR體外模型的建立
　　HepG2細胞經(jīng)高脂干預24小時后，Pa組葡

6、萄糖含量較N組升高，其差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示胰島素敏感性下降，表明棕櫚酸誘導IR體外細胞模型建立成功。
　　2、MTT法觀察藥物干預對HepG2細胞增殖的影響
　　與N組相比，棕櫚酸干預24h能夠使HepG2細胞增殖抑制率上升，抑制率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與Pa組相比，Met、Omt-L、Omt-M、Omt-H均能降低HepG2細胞增殖抑制率（P<0.05），但未能恢復至N組水平，而Omt-

7、H2組則使HepG2細胞增殖抑制率明顯升高，從而選取Omt-L、Omt-M、Omt-H三組的藥物濃度為氧化苦參堿干預濃度。
　　3、HepG2細胞胰島素敏感性的變化
　　3.1胰島素信號通路相關(guān)指標基因表達水平的變化
　　與N組相比,Pa組HepG2細胞INSR、IRS-1、Akt、GLUT4的mRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與Pa組相比,Met、Omt-M、Omt-H組干預后明顯上調(diào)GLUT4的m

8、RNA表達，與對照組無顯著差異（P>0.05），并且同時上調(diào)IRS-1、Akt、INSR的mRNA表達（P<0.05），但未能恢復至N組水平；Omt-L可上調(diào)Akt及INSR的mRNA表達，但未恢復至N組水平（P<0.05），同時明顯上調(diào)GLUT4的mRNA表達（P<0.05），此外，Omt-L組干預后可上調(diào)IRS-1的表達，但差異不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　3.2胰島素信號通路關(guān)鍵分子的蛋白表達水平變化
　　與

9、N組相比，Pa組p-IRS-1/IRS-1的比值顯著升高，p-Akt/Akt與GLUT4/β-actin均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與Pa組相比，二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預組中p-IRS-1/IRS-1的比值顯著減低，而p-Akt/Akt、GLUT4/β-actin均顯著增高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但p-Akt/Akt的比值未能恢復至正常水平。
　　4、藥物干預對HepG2細胞脂代謝的影響

10、
　　4.1藥物干預對HepG2細胞脂質(zhì)沉積的影響
　　油紅O染色及細胞內(nèi)TG含量測定結(jié)果顯示高脂干預后細胞內(nèi)TG含量明顯增加（P<0.05）；與Pa組相比，二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預組HepG2細胞內(nèi)TG含量明顯降低（P<0.05）。
　　4.2棕櫚酸干預后HepG2細胞內(nèi)脂代謝相關(guān)指標表達水平的變化
　　與N組相比，Pa組SREBP-1c、FAS、ACC、SCD-1及CPT-1的mRNA表達水平明顯下降

11、，CD36的mRNA表達水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與N組相比，SREBP-1c、FAS、ACC及SCD-1在Pa組的蛋白表達明顯降低，同時，CD36蛋白表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；
　　4.3藥物干預后脂肪酸轉(zhuǎn)運及氧化關(guān)鍵因子的變化
　　與Pa組相比，二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預組CD36的mRNA水平顯著降低（P<0.05），其蛋白表達明顯下降（P<0.05）；與Pa

12、組相比，二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預組CPT-1的mRNA表達顯著升高（P<0.05）；
　　5、藥物干預對HepG2細胞氧化應激的影響
　　5.1活性氧（ROS）含量
　　與N組相比，Pa組細胞內(nèi)ROS的含量顯著增加；二甲雙胍及不同劑量的氧化苦參堿干預后可以顯著降低ROS含量。
　　5.2抗氧化酶T-SOD、GSH-Px及脂質(zhì)過氧化物MDA的含量
　　HepG2細胞經(jīng)棕櫚酸干預后，抗氧化酶GSH-Px

13、、T-SOD的活性較N組均顯著下降（P<0.05），脂質(zhì)過氧化物MDA的含量明顯增加（P<0.05），不同劑量氧化苦參堿及二甲雙胍干預后，細胞內(nèi)MDA較Pa組明顯減少（P<0.05)，T-SOD及GSH-Px的活性較Pa組明顯增高（P<0.05)，而藥物干預組組間沒有明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、氧化苦參堿可作用于胰島素信號傳導通路，減輕高脂誘導的HepG2細胞IR。
　　2、氧化苦參堿可通過抑制長鏈