津力達(dá)顆粒對調(diào)脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗影響的研究.pdf

1、胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病及多種代謝性疾病的共同病理生理基礎(chǔ)。而氧化應(yīng)激是引起IR的關(guān)鍵性因素。既往有研究表明，復(fù)方制劑津力達(dá)（由人參、黃精、蒼術(shù)、苦參等17味中藥組成）可有效降血糖，改善2型糖尿病患者的癥狀，并具有保護(hù)胰島β細(xì)胞、增加胰島素分泌、改善IR的作用。但其具體機(jī)制尚不明確，本研究擬通過觀察津力達(dá)在體外細(xì)胞水平對高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞IR的影響，探討其改善IR的機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。
　　目的:觀察中藥復(fù)方

2、制劑津力達(dá)對高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗以及氧化應(yīng)激的影響，探討津力達(dá)改善胰島素抵抗的機(jī)制。
　　方法:采用高脂（含0.25 mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)基）干預(yù)法建立HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型。HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為2組，正常對照組和高脂培養(yǎng)基組，分別干預(yù)24小時(shí)后采用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)基中葡萄糖濃度，計(jì)算葡萄糖攝取率，判斷造模成功。造模成功后將高脂培養(yǎng)基組隨機(jī)分為5組，即高脂對照組(PA)、二甲雙胍培養(yǎng)基組(Met)（二

3、甲雙胍濃度為0.2 mg/mL）、津力達(dá)低劑量組（JLD-L）（津力達(dá)濃度為0.75 mg/mL）、津力達(dá)中劑量組（JLD-M）（津力達(dá)濃度為1.5 mg/mL）和津力達(dá)高劑量組(JLD-H)（津力達(dá)濃度為3.0 mg/mL），同時(shí)設(shè)立正常培養(yǎng)基對照組(Con)，二甲雙胍為陽性藥物對照。分別干預(yù)48小時(shí)后收集細(xì)胞，采用相應(yīng)試劑盒測定各組HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，即還原型谷胱甘肽(GSH)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)的含量，過氧化氫酶(

4、CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性;DHE熒光染色檢測HepG2細(xì)胞活性氧簇(ROS)的含量;Real-Time PCR檢測HepG2細(xì)胞胰島素信號通路上胰島素受體(INSR)、胰島素受體底物-1(IRS-1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶β（AKT）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)的mRNA表達(dá)水平;Western Blot檢測HepG2細(xì)胞PI3K總蛋白表達(dá)水平，以及IRS-

5、1、AKT、c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的總蛋白及磷酸化蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1、HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗體外模型建立
　　HepG2細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后PA組培養(yǎng)基中葡萄糖含量較Con組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，胰島素敏感性下降，表明用軟脂酸誘導(dǎo)胰島素抵抗體外細(xì)胞模型成功建立。
　　2、MTT法檢測干預(yù)對HepG2細(xì)胞增殖的影響
　　與Co

6、n組相比，PA組分別干預(yù)24h、48h能夠使HepG2細(xì)胞抑制率升高，增值率下降(P＜0.05);與PA組相比，Met、JLD-L、JLD-M、JLD-H均能提高HepG2細(xì)胞增值率(P＜0.05)，但未能恢復(fù)至Con組水平。
　　3、HepG2細(xì)胞胰島素敏感性的變化
　　(1)胰島素信號通路相關(guān)指標(biāo)基因表達(dá)水平的變化
　　與Con組相比，PA組HepG2細(xì)胞INSR、IRS-1、PI3K、AKT、GLUT2的mRNA

7、表達(dá)下降(P＜0.05);與PA組相比，JLD-L、JLD-M干預(yù)上調(diào)IRS-1、AKT、GLUT2的mRNA表達(dá)(P＜0.05)，而對INSR、PI3K無明顯影響(P＞0.05); Met以及JLD-H均可上調(diào)INSR、IRS-1、PI3K、AKT、GLUT2的mRNA表達(dá)（P＜0.05），但未能恢復(fù)至Con組水平。
　　(2)胰島素信號通路相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)水平的變化
　　與Con組相比，PA組p-IRS-1/IRS-1比

8、值顯著升高，p-AKT/AKT、PI3K/β-actin比值顯著降低(P＜0.05);與PA組相比，Met、JLD-M、JLD-H干預(yù)組p-IRS-1/IRS-1比值顯著降低，p-AKT/AKT、PI3K/β-actin比值顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，JLD-L干預(yù)雖能降低p-IRS-1/IRS-1比值，但未能提高p-AKT/AKT、PI3K/β-actin比值。
　　4、HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激
　　行DH

9、E熒光染色顯示，與Con組相比，PA組的細(xì)胞核內(nèi)的紅色熒光明顯增強(qiáng)，表示細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯增加;不同濃度的津力達(dá)及二甲雙胍干預(yù)可以顯著減少紅色熒光強(qiáng)度，減少ROS生成。HepG2細(xì)胞經(jīng)高脂孵育后，抗氧化酶GSH-Px、T-SOD、CAT的活性均較Con組下降(P＜0.05)，GSH含量降低(P＜0.05)，LPO含量明顯增加(P＜0.05)，藥物干預(yù)后，Met、JLD-L、JLD-M、JLD-H組LPO含量較PA組減少(P＜0.05)

10、，T-SOD、GSH-Px、CAT活性以及GSH含量較PA組增高(P＜0.05)，但藥物干預(yù)組組間沒有明顯差異(P＞0.05)。
　　5、JNK、p38MAPK信號通路
　　與Con組相比，PA組p-JNK/JNK和p-p38MAPK/p38MAPK比值顯著升高(P＜0.05);與PA組相比，津力達(dá)各個(gè)濃度組及二甲雙胍干預(yù)可使p-JNK/JNK和p-p38MAPK/p38MAPK比值顯著降低(P＜0.05)，但二甲雙胍能使上

11、述比值恢復(fù)至正常水平，與對照組無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、津力達(dá)作用于胰島素信號通路，減輕HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗。
　　2、津力達(dá)改善HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激，減少ROS生成，降低LPO含量，恢復(fù)抗氧化酶如SOD、GSH-Px、CAT活性，增加GSH含量。
　　3、津力達(dá)抑制肝臟JNK、p38MAPK應(yīng)激信號通路，恢復(fù)HepG2細(xì)胞胰島素信號傳導(dǎo)。
　　總之，津力達(dá)可改善高脂誘導(dǎo)的H