HBx對HepG2細胞脂代謝的影響及可能的機制.pdf

1、研究背景
　　據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示，我國約有9.3百萬人為慢性乙肝病毒感染者，HBV感染及其導致的各種疾病，是我國所面臨的一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。最近，有報道在CHB和CHC患者中，肝脂肪變性與肝纖維化程度獨立相關，后者與肝硬化和肝癌的發(fā)生密切相關。在HBV感染中肝脂肪變發(fā)生率為27％-51％，但有關HBV與肝脂肪變關系及其相關分子機制，國內外研究很少，尚未達成共識。脂肪肝是病毒感染、飲食等多種因素綜合作用引起的肝臟病變，即脂肪在肝細胞

2、內的過多堆積。近年，隨著人民生活水平越來越高，國民生活方式和膳食模式發(fā)生了相當大的變化，膳食中高脂飲食所占比例呈上升趨勢，同時脂肪肝的發(fā)生率也逐年上升。所以，HBV、高脂環(huán)境與肝脂肪變性的關系的研究具有重要意義。晚近有文獻報道HBx可能在HBV相關的肝細胞脂肪變發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但另有研究者有與此不同的觀點。因此，HBV是否通過HBx參與肝細胞脂肪變性的發(fā)生?其可能的分子機制是否與LXRα、SREBP-1、FAS等調節(jié)脂代謝的重要基

3、因有關?HBV、高脂環(huán)境和肝脂肪變性之間的關系如何?針對以上問題，本研究擬建立表達HBx的HepG2/HBx細胞模型，首先觀察HBx對HepG2細胞脂代謝相關基因表達的影響；在此基礎上進一步研究油酸鈉處理HepG2/HBx細胞與HepG2細胞后，兩細胞內脂質沉積的差異，探討HBx在肝細胞脂代謝中的作用及可能的分子機制。本研究分以下兩部分。
　　第一部分 HBx對HepG2細胞脂代謝相關基因表達的影響
　　目的
　　建立

4、表達HBx的HepG2/HBx細胞模型，探討HBx對脂代謝相關基因表達的影響。
　　方法
　　1.將質粒pIRES2-eGFP-HBx轉染入HepG2中，建立表達HBx的HepG2/HBx細胞模型(HepG2/HBx組)；以轉染空載體pIRES2-eGFP(HepG2/pIRES2組)及未轉染(HepG2組)的HepG2細胞作對照。
　　2.轉染后24h、48h、72h，熒光顯微鏡觀察GFP的表達；檢測細胞內TG含量；

5、RT-PCR方法檢測SREBP-1，LXRα mRNA表達水平；Western blot檢測HBx，LXRα及FAS蛋白表達變化。
　　結果
　　1.在轉染后24h、48h、72h，HepG2/HBx細胞和HepG2/pIRES2細胞中有GFP的表達并隨時間延長而增多、增強，僅在HepG2/HBx細胞內有HBx表達，并且隨轉染時間的延長而逐漸增加(P<0.05)。
　　2.在轉染后24h、48h、72h，HepG2/H

6、Bx細胞內LXR、SREBP-1的mRNA表達以及LXRα、FAS蛋白表達，在各相同時間點均較對照組明顯增加(P<0.05/0.01)，隨時間的延長而逐漸增多(P<0.05/0.01)，且與HBx表達量均呈正相關(P<0.05)。HepG2/HBx細胞內TG含量與對照組相比，差異尚無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論
　　1.成功建立HepG2/HBx細胞模型。
　　2.HBx-L XRα-SREBP-1/FAS通

7、路參與調節(jié)脂質代謝相關基因的轉錄和表達，可能是引起肝細胞脂肪變性發(fā)生的重要分子機制之一。
　　第二部分 HBx對油酸鈉誘導HepG2細胞脂質沉積的影響
　　目的
　　在HepG2-HBx細胞模型基礎上給予油酸鈉處理，探討HBx對油酸鈉誘導HepG2細胞脂質沉積的影響。
　　方法
　　1.將質粒pIRES2-eGFP-HBx轉染入HepG2細胞中，建立表達HBx的細胞模型(HepG2-HBx)；以轉染空載體p

8、IRES2-eGFP(HepG2-pIRES2)和HepG2細胞(HepG2)作對照。轉染后每8h用熒光顯微鏡分別觀察各組細胞內GFP的表達，取轉染后首次觀察到GFP表達的時間點作為開始給于油酸鈉處理的時間點。
　　2.油酸鈉處理各組細胞24h、48h(分別命名為HBx/OA組、空/OA組、G2/OA組)，TG含量測定及油紅O染色了解細胞內脂質沉積情況；RT-PCR法檢測SREBP-1和LXRa的mRNA表達水平，Western

9、blot檢測HBx、LXRa及FAS蛋白表達變化。
　　結果
　　1.油酸鈉處理時間點的確定：在轉染后8h各組細胞內均未觀察到綠色熒光，而轉染后16h觀察到HepG2-HBx組和HepG2-pIRES2組細胞內有綠色熒光，故選擇轉染后16h作為開始給于油酸鈉處理的時間點。
　　2.在相同油酸鈉處理的條件下，HBx/OA組細胞內脂滴數(shù)量和TG含量與對照組相比均明顯增加(P<0.01)；給予油酸鈉處理細胞24h，HBx/O