印跡基因TSSC3對骨肉瘤生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的一種高轉(zhuǎn)移性骨原發(fā)惡性腫瘤，肺轉(zhuǎn)移是最主要的死亡原因。骨肉瘤的轉(zhuǎn)移多發(fā)生于早期，85%～90%的患者就診時(shí)已存在臨床上不能發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移灶。近年來的新輔助化療使得患者肺轉(zhuǎn)移率得到明顯控制，骨肉瘤患者的預(yù)后得到了很大的提高，5年生存率達(dá)到60%～80%。但骨肉瘤的長期生存率并沒有明顯提高，骨肉瘤的治療效果仍處于“瓶頸期”，骨肉瘤細(xì)胞對化療的敏感性差以及對化療藥物的耐藥是影響其化療療效的主要因素。因此，控制骨肉瘤的轉(zhuǎn)

2、移和克服化療耐藥對于提高骨肉瘤患者的生存率有重要意義。
　　 腫瘤的轉(zhuǎn)移包含了一系列的復(fù)雜事件。腫瘤細(xì)胞獲得“失巢凋亡抵抗”是其成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，而細(xì)胞周期阻滯和凋亡通路障礙也是化療耐藥產(chǎn)生的主要機(jī)制之一，因此探討骨肉瘤耐藥及失巢凋亡抵抗的機(jī)制將為深入闡明骨肉瘤轉(zhuǎn)移及耐藥提供有意義的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，印跡基因TSSC3參與了成骨細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。TSSC3是已報(bào)道的唯一與凋亡相關(guān)的印跡基

3、因。目前關(guān)于TSSC3與腫瘤的研究很少，僅在完全性葡萄胎、Wilms’腫瘤和惡性膠質(zhì)瘤中有表達(dá)缺失的報(bào)道，其在骨肉瘤中的表達(dá)情況及其發(fā)揮的功能作用和分子機(jī)制尚缺乏相關(guān)研究。
　　 有鑒于此，本研究共分三部分。第一部分檢測了TSSC3在各骨肉瘤細(xì)胞系以及骨肉瘤組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究TSSC3在骨肉瘤中所發(fā)揮的功能作用。第二部分探討了TSSC3對各凋亡通路關(guān)鍵分子表達(dá)變化的影響；并進(jìn)一步探討了TSSC3對

4、骨肉瘤化療敏感性的影響及其分子機(jī)制。第三部分在第一、二部分對TSSC3在骨肉瘤中表達(dá)、功能及作用機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討TSSC3調(diào)控骨肉瘤失巢凋亡抵抗進(jìn)而在骨肉瘤遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用及其分子機(jī)制。
　　 研究內(nèi)容和主要結(jié)果結(jié)論如下：
　　 一、TSSC3在骨肉瘤細(xì)胞系和骨肉瘤組織中普遍低表達(dá)，提示其表達(dá)可能與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)
　　 1.TSSC3在骨肉瘤細(xì)胞系中普遍低表達(dá)：
　　 采

5、用熒光定量PCR、RT-PCR和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)方法得到如下結(jié)果：
　　 (1)TSSC3在惡性轉(zhuǎn)化的成骨細(xì)胞(MTF)中的表達(dá)明顯低于hFOB1.19成骨細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)TSSC3在成骨細(xì)胞系中的表達(dá)均高于所有被檢測的骨肉瘤細(xì)胞系，其在低級別來源的骨肉瘤細(xì)胞系HOS和MG63中的表達(dá)要高于高級別來源的細(xì)胞系U2OS和SaOS2，且TSSC3主要定位于胞質(zhì)。
　　 2.TSSC3在骨肉瘤組織

6、中普遍低表達(dá)：
　　 我們采用RT-PCR和卡方檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到如下結(jié)果：
　　 (1)TSSC3在腫瘤組織(陽性率為45.8%，表達(dá)豐度為0.18±0.03)中的表達(dá)顯著低于配對癌旁組織(陽性率為79.1%，表達(dá)豐度為0.52±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)TSSC3在骨肉瘤組織(54.2%)中的表達(dá)缺失率顯著高于配對癌旁組織(20.8%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但骨肉瘤組織中TSSC3的表達(dá)缺失

7、率與骨肉瘤患者的性別、年齡和病理組織學(xué)分型沒有顯著的相關(guān)性。
　　 二、TSSC3的表達(dá)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖
　　 1.采用GeneSwitch誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)TSSC3的SaOS2細(xì)胞系(overTSSC3)；采用pSilencer5.1 Retro表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了穩(wěn)定低表達(dá)TSSC3的SaOS2細(xì)胞系(siTSSC3)。
　　 2.TSSC3的表達(dá)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖：
　　 (

8、1)CCK8比色法顯示：overTSSC3細(xì)胞在接種2天后，增殖速率顯著低于對照組(SaOS2和overCON)；相反，siTSSC3細(xì)胞在接種5天后，增殖速率顯著高于對照組(SaOS2和siCON)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示：過表達(dá)TSSC3明顯地降低了大克隆形成率(從17.75±0.01%降低到0.67±0.01%)；相反，siTSSC3細(xì)胞的總克隆、大克隆、小克隆形成數(shù)均顯著高于對照組(SaOS

9、2和siCON)，特別是大克隆形成數(shù)從7±2升高到107±12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)Ki67免疫熒光染色顯示：高表達(dá)TSSC3明顯地降低了Ki67的表達(dá)強(qiáng)度和陽性率；反之，低表達(dá)TSSC3則顯著地增強(qiáng)了Ki67的表達(dá)強(qiáng)度和陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (4)PI染色和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA倍體分析顯示：高表達(dá)TSSC3使G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加；反之，低表達(dá)TSSC3則使G0/G1期細(xì)胞比例顯著降

10、低。
　　 3.TSSC3的表達(dá)抑制了裸鼠體內(nèi)骨肉瘤細(xì)胞的增殖：
　　 (1)免疫缺陷小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示：overTSSC3組成瘤率為18%，成瘤潛伏期為28天，接種7周后移植瘤體積為15.94±9.28(mm3±SD)；對照組SaOS2、overCON的成瘤率分別為86%和67%，成瘤潛伏期分別為14天和16天，接種7周后移植瘤體積分別為90.17±15.42(mm3±SD)和159.75±73.65(mm3±SD)，

11、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相反，siTSSC3組成瘤率為100%，成瘤潛伏期為6天，接種5周后移植瘤體積為153.45±42.38(mm3±SD)；siCON組成瘤率為67%，成瘤潛伏期為12天，接種5周后移植瘤體積為66.10±24.64(mm3±SD)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明TSSC3明顯地降低了骨肉瘤細(xì)胞體內(nèi)的成瘤力。
　　 (2)HE染色觀察移植瘤組織形態(tài)，結(jié)果顯示：siTSSC3和SaOS2組來源的移植瘤，細(xì)胞大小不一，細(xì)

12、胞核深染且異形性大，可見部分病理性核分裂像，有較多的壞死灶和高密度的微血管；而在overTSSC3組來源的移植瘤組織中，沒有觀察到壞死組織、病理性核分裂像以及高密度的微血管。結(jié)果說明低表達(dá)TSSC3使移植瘤更加接近于骨肉瘤的組織學(xué)特征。
　　 (3)免疫組化染色檢測移植瘤組織中TSSC3、Ki67表達(dá)，結(jié)果顯示：overTSSC3組高表達(dá)TSSC3，SaOS2組弱表達(dá)TSSC3，siTSSC3組中未檢測到TSSC3的表達(dá)。采用K

13、i67染色，對瘤體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖活性進(jìn)行標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，overTSSC3組低表達(dá)Ki67，siTSSC3組高表達(dá)Ki67，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明TSSC3在移植瘤組織中的表達(dá)與Ki67的表達(dá)負(fù)相關(guān)。
　　 三、TSSC3的表達(dá)通過線粒體途徑促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的凋亡
　　 1.TSSC3的表達(dá)促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的凋亡：
　　 (1)倒置顯微鏡下觀察，對照組SaOS2、overCON細(xì)胞呈短梭形，折光性強(qiáng)，透明度大，輪

14、廓不清，胞質(zhì)中未見顆粒樣物質(zhì)；而overTSSC3細(xì)胞則生長緩慢，形態(tài)不規(guī)則，失去原有特點(diǎn)，折光性降低，細(xì)胞間隙增大，胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞活力差，并有較多懸浮細(xì)胞。透射電鏡下觀察，overTSSC3細(xì)胞較對照組顯示出了凋亡的特征，核膜不規(guī)則，核濃縮碎裂，出現(xiàn)新月體形核，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡及凋亡小體。以上形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果提示了TSSC3對細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。
　　 (2)AnnexinV/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果

15、顯示：相對于對照組，overTSSC3組的早期凋亡和晚期凋亡率分別從5.70%和1.39%明顯地提高到了14.70%和9.97%。相反，低表達(dá)TSSC3使早期和晚期凋亡率分別下調(diào)了4.04倍和4.32倍。另外，我們采用PI染色檢測亞G0期細(xì)胞的比率，細(xì)胞的凋亡率隨著TSSC3的表達(dá)下調(diào)而下降。TUNEL染色的結(jié)果同樣顯示了在overTSSC3細(xì)胞中，F(xiàn)ITC陽性細(xì)胞的表達(dá)要明顯地高于對照組。
　　 2.TSSC3的表達(dá)促進(jìn)了瘤體

16、細(xì)胞的凋亡：移植瘤組織TSSC3和TUNEL免疫熒光雙染結(jié)果顯示：相對于對照組，overTSSC3細(xì)胞來源的移植瘤組織中TSSC3和TUNEL染色的比例和強(qiáng)度同時(shí)明顯地增加，且共定位于同一細(xì)胞中，結(jié)果表明持續(xù)的TSSC3表達(dá)明顯增加了瘤體細(xì)胞的凋亡。
　　 3.TSSC3通過線粒體凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡：
　　 (1)熒光定量PCR結(jié)果顯示：高表達(dá)TSSC3明顯地增加了caspase-3和Cytc的表達(dá)，并

17、同時(shí)上調(diào)了Bax：Bcl-2的比率；對于死亡受體通路而言，TSSC3的上調(diào)反而引起了Fas的下調(diào)以及Flip的上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。反之，相對于siCON細(xì)胞，在siTSSC3細(xì)胞中caspase-3，Cytc，Bax：Bcl-2和Flip分子明顯地下調(diào)，F(xiàn)as則明顯地上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3在基因水平通過上調(diào)內(nèi)源性線粒體通路發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　 (2)免疫熒光染色結(jié)果顯示：相對于overCON細(xì)胞，

18、overTSSC3細(xì)胞上調(diào)了cleavedcaspase-3的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)procaspase-9和Bcl-2的表達(dá)。相反，相對于siCON細(xì)胞，procaspase-9和Bcl-2在siTSSC3細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，但是procaspase-8的表達(dá)在overTSSC3細(xì)胞和overCON細(xì)胞中沒有明顯的不同。Western Blot檢測結(jié)果顯示：高表達(dá)TSSC3明顯增加了cleaved caspase-3和Cytc蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)

19、顯著下調(diào)了Fas蛋白的表達(dá)；而Cytc在siTSSC3細(xì)胞中的表達(dá)則明顯低于siCON細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3在蛋白水平通過上調(diào)內(nèi)源性線粒體通路發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　 (3)JC-1染色結(jié)果顯示：overCON細(xì)胞展示出桔紅色的熒光，代表正常細(xì)胞線粒體的JC-1聚合體，而在overTSSC3細(xì)胞中紅色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色熒光，更加接近于陽性對照，代表凋亡細(xì)胞線粒體的JC-1單體。TSSC3使綠色/紅色熒光強(qiáng)度的

20、比值從0.90±0.04增加到4.31±0.87，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3破壞了線粒體膜電位，誘導(dǎo)了內(nèi)源性凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　 四、TSSC3通過誘導(dǎo)線粒體途徑的凋亡增加了骨肉瘤細(xì)胞對化療的敏感性
　　 1.TSSC3通過誘導(dǎo)凋亡增加了骨肉瘤細(xì)胞對化療的敏感性：
　　 (1)AnnexinV/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示：順鉑和表柔比星處理后，overTSSC3細(xì)胞的凋亡率(特別

21、是晚期凋亡率)明顯地高于overCON細(xì)胞。而低表達(dá)TSSC3則明顯地降低了化療藥處理后細(xì)胞的凋亡。
　　 (2)TUNEL免疫熒光染色結(jié)果顯示：overTSSC3細(xì)胞在化療藥處理后FITC熒光強(qiáng)度明顯地高于對照細(xì)胞。
　　 2.TSSC3通過線粒體凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑明顯地增加了骨肉瘤細(xì)胞對化療藥處理的敏感性：
　　 (1)免疫熒光染色結(jié)果顯示：化療藥處理后，cleaved caspase-3在overTSSC3細(xì)

22、胞表達(dá)強(qiáng)度顯著高于overCON細(xì)胞。Western Blot檢測結(jié)果顯示：Cytc、cleaved caspase-3以及cleaved PARP在overTSSC3細(xì)胞的表達(dá)水平顯著地高于對照細(xì)胞；相反，Cytc在siTSSC3細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于siCON細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)JC-1免疫熒光染色結(jié)果顯示：化療藥處理后，JC-1單體在overTSSC3細(xì)胞中的表達(dá)明顯地高于overCON細(xì)胞，高表達(dá)TSSC

23、3使綠色/紅色熒光強(qiáng)度的比值從1.33±0.67增加到6.73±1.65，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。線粒體膜電位的破壞以及Cytc等凋亡分子在overTSSC3細(xì)胞中表達(dá)的增加，說明TSSC3通過線粒體途徑促進(jìn)了化療藥引起的骨肉瘤細(xì)胞凋亡。
　　 五、TSSC3在失巢凋亡抵抗逐漸增強(qiáng)的過程中漸進(jìn)性地表達(dá)下調(diào)
　　 1.成功建立了骨肉瘤細(xì)胞失巢凋亡抵抗模型：
　　 (1)懸浮-貼壁循環(huán)培養(yǎng)法建立骨肉瘤失巢凋亡抵抗細(xì)胞模型：

24、SaOS2懸浮3天后，貼壁培養(yǎng)直至長成單細(xì)胞層，再次懸浮14天后再次貼壁培養(yǎng)，所形成的單層細(xì)胞即為失巢凋亡抵抗細(xì)胞，記為SaOSar。懸浮培養(yǎng)后細(xì)胞變圓，最初為散在的單個(gè)細(xì)胞逐漸成團(tuán)生長，隨著時(shí)間的推移細(xì)胞團(tuán)塊不斷增大、致密。
　　 (2)骨肉瘤細(xì)胞失巢凋亡抵抗模型的鑒定：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測失巢凋亡細(xì)胞模型中各時(shí)相點(diǎn)懸浮細(xì)胞的凋亡率，貼壁培養(yǎng)SaOS2細(xì)胞的凋亡率(僅指早期凋亡率)為4.34%，懸浮24h之內(nèi)凋亡率上升得最快，達(dá)

25、到20.36%，3天和7天時(shí)分別為33.76%和49.36%，7天后凋亡率上升逐漸變緩，到14天時(shí)為55.28%，14天后凋亡率無顯著變化。SaOS2與SaOSar細(xì)胞懸浮24h后檢測凋亡率，前者的早期與晚期凋亡率分別為14.39%和21.79%，而后者僅為5.35%和10.07%。
　　 2.TSSC3在失巢凋亡抵抗逐漸增強(qiáng)的過程中漸進(jìn)性地表達(dá)下調(diào)：
　　 采用熒光定量PCR、免疫熒光染色的實(shí)驗(yàn)方法得到如下結(jié)果：

26、>　　 (1)TSSC3在失巢凋亡抵抗逐漸增強(qiáng)的過程中漸進(jìn)性地表達(dá)下調(diào)。其中懸浮第1天和第7天下降幅度最顯著，都較其前一時(shí)間點(diǎn)下降了65%，懸浮第14天后TSSC3的表達(dá)與未懸浮的SaOS2細(xì)胞相比下降了95%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)相對于SaOS2細(xì)胞，TSSC3 mRNA和蛋白的表達(dá)在SaOSar細(xì)胞中分別下調(diào)了56%和55%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)TSSC3的表達(dá)在MTF中較hFOB1.19成

27、骨細(xì)胞下降了67%，在MTFar中較MTF下降了15%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 綜合以上結(jié)果提示TSSC3可能通過表達(dá)抑制參與骨肉瘤的失巢凋亡抵抗，進(jìn)而促進(jìn)了骨肉瘤的演進(jìn)。
　　 六、TSSC3通過調(diào)控EMT相關(guān)分子以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的表達(dá)促進(jìn)了MET，抑制了骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能
　　 1.TSSC3的表達(dá)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力：采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，結(jié)果顯示：overTSSC3和o

28、ver overTSSC3ar細(xì)胞向致傷區(qū)遷移的距離明顯小于各自的對照細(xì)胞，而siTSSC3細(xì)胞則明顯大于siCON細(xì)胞。
　　 2.TSSC3的表達(dá)顯著地降低了細(xì)胞的侵襲能力：采用Transwell侵襲小室法測定細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示：overTSSC3和overTSSC3ar的下室細(xì)胞數(shù)顯著低于各自對照細(xì)胞，overTSSC3和overCON分別為8±2和105±16，overTSSC3ar和overCONar分別為40±

29、6和179±26，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而siTSSC3的下室細(xì)胞則明顯多于siCON細(xì)胞，siTSSC3和siCON分別為158±11和30±5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.TSSC3的表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞EMT相關(guān)分子以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子表達(dá)的影響：
　　 采用熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)方法得到如下結(jié)果：
　　 (1)高表達(dá)TSSC3增加了上皮標(biāo)志E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了間質(zhì)相關(guān)標(biāo)志N-cadherin、Vim

30、entin、Fibronectin以及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist、Snail、Slug、Smadl、Smad4、ZEB1、ZEB2的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果說明：高表達(dá)TSSC3使骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生了MET。
　　 (2)高表達(dá)TSSC3降低了轉(zhuǎn)移相關(guān)分子CD44s、CXCR4及金屬蛋白酶家族分子MMP2、MMP7、MMP9、MMP14的表達(dá)，同樣在失巢凋亡抵抗細(xì)胞中過表達(dá)TSSC3也得到了同樣的結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相反，

31、低表達(dá)TSSC3上調(diào)了CD44s、CXCR4、MMP7、MMP14的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果說明：高表達(dá)TSSC3在基因水平下調(diào)了骨肉瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的潛能。
　　 七、TSSC3通過抑制整合蛋白信號傳導(dǎo)激酶Src介導(dǎo)的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號通路從而促進(jìn)了骨肉瘤的失巢凋亡，并增加了失巢凋亡細(xì)胞對化療藥的敏感性
　　 1.TSSC3抑制整合蛋白信號傳導(dǎo)激酶Src介導(dǎo)的PI3 K/Akt失巢凋亡抵抗信號通路從而

32、通過線粒體途徑促進(jìn)了骨肉瘤的失巢凋亡：
　　 (1)倒置顯微鏡下觀察各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞懸浮狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)：與對照組相比，overTSSC3細(xì)胞團(tuán)塊較小且松散，有較多散在的凋亡細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測各細(xì)胞懸浮3天的失巢凋亡率顯示：SaOS2、overCON、overTSSC3分別為31.20%、31.00%、47.90%(早期凋亡率)；相反，siTSSC3細(xì)胞團(tuán)塊較大且緊密，散在的凋亡細(xì)胞較少。流式細(xì)胞術(shù)檢測各細(xì)胞懸浮1天的失巢凋亡率顯

33、示：siCON、siTSSC3分別為22.70%、3.52%(早期凋亡率)，且siTSSC3細(xì)胞的失巢凋亡率與抗失巢凋亡細(xì)胞SaOSar相近(8.55%)。結(jié)果表明：TSSC3促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的失巢凋亡。
　　 (2)JC-1染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位的改變，結(jié)果顯示：懸浮3天后，overTSSC3 JC-1單體所占的比例為36.5%，明顯高于對照細(xì)胞overCON(14.4%)和SaOS2(13.9%)。Western

34、Blot結(jié)果顯示：overTSSC3細(xì)胞溶質(zhì)中Cytc的表達(dá)量顯著高于overCON，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3破壞了骨肉瘤失巢凋亡細(xì)胞的線粒體膜電位從而促進(jìn)了Cytc的釋放。
　　 (3)熒光定量PCR的結(jié)果顯示：高表達(dá)TSSC3增加了Puma、Noxa、Bim、Bax、Bak、Cytc、Apaf-1和caspase-3的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，從各個(gè)環(huán)節(jié)促進(jìn)了線粒體途徑的失巢凋亡，差異有統(tǒng)

35、計(jì)學(xué)意義。相反，低表達(dá)TSSC3降低了Puma、Noxa、Bax、Cytc和caspase-3的表達(dá)，同時(shí)升高了Bcl-2的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，overTSSC33day細(xì)胞中Bax/Bcl-2的比值為5.97，而overCON3day細(xì)胞中為0.40，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3通過線粒體凋亡信號途徑增加了骨肉瘤細(xì)胞對失巢凋亡的敏感性。
　　 (4)熒光定量PCR的結(jié)果顯示：高表達(dá)TSSC3同時(shí)降低了int

36、egrinβ4與Ezrin的表達(dá)，上調(diào)了integrinα2、integrinβ1的表達(dá)，且TSSC3與Caveolin-1的表達(dá)正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3參與調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞失巢凋亡信號途徑中的多個(gè)分子。
　　 (5)Western Blot檢測結(jié)果顯示：過表達(dá)TSSC3使懸浮細(xì)胞整合素蛋白信號傳導(dǎo)激酶Src的磷酸化水平降低，P-Akt降低，Akt升高，P-Bad降低，促進(jìn)了Cytc從線粒體釋放到胞質(zhì)，cle

37、aved caspase-3升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3抑制了整合蛋白信號傳導(dǎo)激酶Src介導(dǎo)的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號通路從而通過線粒體途徑促進(jìn)了骨肉瘤的失巢凋亡。
　　 2.TSSC3通過抑制整合蛋白信號傳導(dǎo)激酶Src介導(dǎo)的PI3 K/Akt信號通路增加了失巢凋亡細(xì)胞對化療藥的敏感性：
　　 (1)AnnexinV/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率顯示：懸浮狀態(tài)下用化療藥處理各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞3天，

38、SaOS2、overCON凋亡率分別為59.90%、56.90%，而overTSSC3則達(dá)到78.60%。結(jié)果表明：高表達(dá)TSSC3顯著地增加了失巢凋亡細(xì)胞對化療藥的敏感性。
　　 (2)JC-1染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示：懸浮狀態(tài)下用化療藥處理各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞3天，SaOS2、overCON、overTSSC3細(xì)胞JC-1單體的比例分別為42.8%、35.6%、63.4%。結(jié)果表明：高表達(dá)TSSC3通過線粒體通路促進(jìn)了失巢凋亡細(xì)胞化

39、療藥處理后引起的凋亡。
　　 (3)Western Blot檢測顯示：懸浮狀態(tài)下用化療藥處理各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞3天，高表達(dá)TSSC3降低了化療藥處理后失巢凋亡細(xì)胞P-Src和P-Akt的表達(dá)，同時(shí)增加了cleavedcaspase-3的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明：TSSC3通過抑制整合素介導(dǎo)的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號增加了失巢凋亡細(xì)胞對化療藥的敏感性。
　　 綜上所述，本研究的主要結(jié)論是：
　　 1.印跡

40、基因TSSC3在骨肉瘤中低表達(dá)，它通過抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抑癌基因作用，其機(jī)制可能為通過調(diào)控線粒體途徑增加骨肉瘤的基礎(chǔ)凋亡率和化療敏感性。
　　 2.印跡基因TSSC3可通過調(diào)控EMT相關(guān)分子以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子CD44s、CXCR4和MMP家族分子的表達(dá)促進(jìn)MET，抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。
　　 3.印跡基因TSSC3在骨肉瘤細(xì)胞失巢凋亡抵抗逐漸增強(qiáng)的過程中漸進(jìn)性地表達(dá)下調(diào)，其機(jī)制可能為通過抑制整

41、合蛋白信號傳導(dǎo)激酶Src介導(dǎo)的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信號通路從而促進(jìn)骨肉瘤的失巢凋亡，并增加失巢凋亡細(xì)胞對化療藥的敏感性。
　　 本研究首次報(bào)道了印跡基因TSSC3在骨肉瘤發(fā)生和演進(jìn)過程中的表達(dá)變化、功能及作用機(jī)制。從印跡基因的角度探討了骨肉瘤失巢凋亡及耐藥的分子機(jī)制。提出了印跡基因TSSC3作為抑癌基因可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡(包括失巢凋亡)，并通過調(diào)控EMT相關(guān)分子以及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的表達(dá)促進(jìn)了MET，抑制了骨肉瘤