抗衰老蛋白Klotho通過TLR4-NF-κB p65-NGAL通路對糖尿病腎臟疾病的作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　探討Klotho和NGAL在DKD中的表達(dá)，并深入研究二者在糖尿病腎臟損傷過程中的作用機(jī)制，探索TLR4/NF-κB p65信號通路在該過程中的作用。闡明上述問題，為明確DKD發(fā)病機(jī)制提供更充分的理論依據(jù)，可望為DKD的防治提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　方法：
　　第一部分 2型糖尿病患者不同尿白蛋白階段血清sKlotho蛋白與NGAL的水平變化及其相關(guān)性研究
　　根據(jù)1999年WHO的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇我

2、院T2DM患者462例，男214例，女248例，年齡52.91±6.33歲，均排除70歲以上及30歲以下，1型及繼發(fā)性糖尿病，其他腎臟疾病，近3個月發(fā)生糖尿病急性并發(fā)癥及感染，急性感染性疾病，心肝功能不良，高血壓，惡性腫瘤，妊娠、哺乳，結(jié)締組織病和自身免疫性疾病，使用血管緊張素受體拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑類藥物等。
　　根據(jù)尿白蛋白/肌酐比率(UACR)將患者分為以下3組:正常白蛋白尿(N-UAlb)組（＜30 mg/g，1

3、80例）、微量白蛋白尿(M-UAlb)組(30～300 mg/g,158例)和大量白蛋白尿(L-UAlb)組（＞300 mg/g，124例）。隨機(jī)挑選我院體檢中心與之年齡相匹配的健康志愿者160例為正常對照(NC)組，男78例，女82例，年齡51.18±6.49歲。
　　采集研究對象晨起空腹靜脈血，受試者取舒適體位，取肘前靜脈無菌采血5mL標(biāo)本室溫靜置30 min后，血液不抗凝，3000 r/min，低溫離心15 min，取上層血

4、清。采用ELISA法測定血清sKlotho、NGAL、8-Iso-PGF2α、MCP-1、TNF-α、TGF-β1水平
　　第二部分 TLR4/NF-κB p65促進(jìn)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞NGAL的表達(dá)及其作用機(jī)制
　　取5～9代對數(shù)生長期HBZY-1大鼠腎小球系膜細(xì)胞(RMCs)，以細(xì)胞濃度為5×105個細(xì)胞接種6孔板中（用于熒光實(shí)時定量PCR及ELISA檢測）及細(xì)胞濃度為2×106個細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中（用

5、于Western Blot印跡檢測），培養(yǎng)細(xì)胞待其貼壁融合40％～60％后用無血清1640培養(yǎng)基同步化24h，分組處理:(1)正常糖組（5.5mmol/L葡萄糖，NG），(2)高滲組（5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇，HM），(3)高糖組（30mmol/L葡萄糖，HG），(4) HG+siRNA-NGAL組，(5) HG+ siRNA-TLR4，(6) HG+PDTC組。培養(yǎng)4h、8h、16h、24h、48h收獲細(xì)胞

6、。
　　應(yīng)用基因沉默技術(shù)干擾NGAL、TLR4的表達(dá);采用熒光實(shí)時定量PCR法檢測各組細(xì)胞TLR4、NGALmRNA的表達(dá);Western Blot檢測FN、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、CTGF、NGAL的表達(dá)水平;ELISA檢測細(xì)胞清液MCP-1、CXCL5的表達(dá)水平。
　　第三部分 Klotho對高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞TLR4/NF-κ B p65/NGAL信號通路的作用及機(jī)制
　　

7、取5～9代對數(shù)生長期HBZY-1 RMCs，以細(xì)胞濃度為5×105個細(xì)胞接種6孔板中（用于熒光實(shí)時定量PCR及ELISA檢測）及細(xì)胞濃度為2×106個細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中（用于Western Blot印跡檢測），培養(yǎng)細(xì)胞待其貼壁融合40％～60％后用無血清1640培養(yǎng)基同步化24h，分組處理:(1)正常糖組（5.5mmol/L葡萄糖，NG），(2)高滲組（5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇，HM），(3)高糖組

8、（30mmol/L葡萄糖，HG），(4) HG+Klotho組。培養(yǎng)4h、8h、16h、24h、48h收獲細(xì)胞。
　　以外源性重組Klotho蛋白處理高糖培養(yǎng)的RMCs;采用熒光實(shí)時定量PCR法檢測各組細(xì)胞Klotho mRNA的表達(dá);Western Blot檢測FN、Klotho、TLR4、NF-κBp65、p-NF-κB p65、CTGF、NGAL的表達(dá)水平;ELISA檢測細(xì)胞上清液MCP-1、CXCL5的表達(dá)水平。
　

9、　結(jié)果：
　　第一部分 2型糖尿病患者不同尿白蛋白階段血清sKlotho蛋白與NGAL的水平變化及其相關(guān)性研究
　　(1)糖尿病患者與NC組相比，血清sKlotho水平明顯下降，血清NGAL，8-Iso-PGF2α，MCP-1，TNF-α，TGF-β1水平明顯上升，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;在T2DM不同尿白蛋白組間各血清水平也有著明顯差異。
　　(2)多元逐步回歸分析結(jié)果顯示，T2DM不同尿白蛋白組患者中病程和UACR是

10、影響血清sKlotho水平的獨(dú)立相關(guān)因素，UACR、TG、HDL水平是影響血清NGAL水平的獨(dú)立相關(guān)因素，Scr、BUN、HDL、sKlotho、NGAL、8-Iso-PGF2α、MCP-1、TNF-α、TGF-β1為影響UACR水平的獨(dú)立相關(guān)因素。
　　(3)直線回歸分析發(fā)現(xiàn)，T2DM不同尿白蛋白組患者血清sKlotho水平與NGAL水平呈顯著負(fù)相關(guān)，血清sKlotho水平還與血清8-Iso-PGF2α，MCP-1，TNF-α,

11、TGF-β1水平呈顯著負(fù)相關(guān);而血清NGAL水平與血清8-Iso-PGF2α，MCP-1，TNF-α，TGF-β1水平呈顯著正相關(guān)。
　　第二部分 TLR4/NF-κB p65促進(jìn)高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞NGAL的表達(dá)及其作用機(jī)制
　　(1)高糖通過上調(diào)RMCs中NGAL的表達(dá)而刺激纖維化因子及炎癥因子的產(chǎn)生
　　Real-Time PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖可促進(jìn)NGAL mRNA表達(dá)升高并呈時間依賴性，其在24h達(dá)

12、到峰值，表達(dá)量為NG組的2.58倍。Western Blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)較NG組，HG組NGAL蛋白表達(dá)明顯升高。
　　以基因沉默干擾技術(shù)抑制RMCs中NGAL的表達(dá)后，采用ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液炎癥因子MCP-1及CXCL5的表達(dá)量，采用Western Blot檢測各組細(xì)胞纖維化因子FN、CTGF的表達(dá)量，結(jié)果顯示HG組較NG組表達(dá)均有顯著升高，而基因沉默組較HG組表達(dá)明顯下降。
　　(2)高糖通過激活RMCs中T

13、LR4/NF-κB p65信號通路而上調(diào)NGAL的表達(dá)
　　Real-Time PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)HG可促進(jìn)TLR4 mRNA表達(dá)升高并呈時間依賴性，其在16h達(dá)到峰值，表達(dá)量為NG組的2.43倍。Western Blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)較NG組，HG組TLR4蛋白表達(dá)明顯升高，且伴有NF-κB p65磷酸化蛋白水平明顯升高。
　　以基因沉默干擾技術(shù)抑制RMCs中TLR4的表達(dá)后，Western Blot檢測各組細(xì)胞NF-κB

14、p65磷酸化蛋白及NGAL蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示基因沉默組較HG組表達(dá)明顯下降。以NF-κB p65的特異性抑制劑PDTC處理高糖培養(yǎng)的RMCs后，Western Blot檢測結(jié)果提示HG+PDTC組NGAL蛋白表達(dá)水平較HG組明顯下降。
　　第三部分 Klotho對高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞TLR4/NF-κB p65/NGAL信號通路的作用及機(jī)制
　　(1)高糖抑制體外培養(yǎng)的RMCs中Klotho的表達(dá)
　　相較于

15、NG組，HG組培養(yǎng)8h時Klotho mRNA表達(dá)已明顯降低，Western Blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)較NG組，HG組Klotho蛋白表達(dá)也明顯下降。
　　(2)外源性重組Klotho蛋白可抑制體外培養(yǎng)的RMCs中高糖激活的TLR4/NF-κB p65/NGAL信號通路
　　以Klotho重組蛋白處理高糖培養(yǎng)的RMCs后，Western Blot檢測結(jié)果提示HG+KL組較HG組TLR4蛋白、NF-κB p65磷酸化蛋白及NGAL

16、蛋白表達(dá)均有顯著降低。
　　(3)外源性重組Klotho蛋白可抑制高糖培養(yǎng)的RMCs中炎癥因子及纖維化因子的表達(dá)
　　以Klotho重組蛋白處理高糖培養(yǎng)的RMCs后，采用ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液MCP-1及CXCL5的表達(dá)值，采用Western Blot檢測各組細(xì)胞FN、CTGF的表達(dá)量，結(jié)果顯示HG+KL組較HG組表達(dá)均有顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1、T2DM患者血清sKlotho水平隨著尿白蛋白水平的