梓葛凍干粉針對大鼠急性腦缺血損傷半暗帶神經血管單元的整體保護作用.pdf

1、1.研究背景
　　抑制或減輕中風急性期半暗帶細胞凋亡或死亡，避免梗死灶擴大，是公認的較為理想的缺血性中風腦保護策略。課題組自主研制的抗中風藥物—梓葛凍干粉針(由地黃藥效成分梓醇和葛根藥效成分葛根素組成），在永久缺血性腦中風模型大鼠和小鼠的非急性期，以及缺血再灌注損傷的腦中風模型大鼠中，均表現(xiàn)出較好的腦保護作用。然而，梓葛凍干粉針對永久缺血性腦中風模型大鼠急性期的腦保護作用尚未觀察，其對腦缺血半暗帶中神經血管單元細胞的整體保護作用及

2、其可能的通路機制有待研究。本研究獲得了國家自然科學基金面上項目（81473549）、教育部博士學科點專項基金項目（博導類：20110182110012）、教育部中央高?；究蒲袠I(yè)務費項目（XDJK2014D023）以及重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研重大項目（渝中醫(yī)2010[60]2010-1-4）的支持。
　　2.研究目的
　　研究梓葛凍干粉針對永久缺血性腦中風模型大鼠急性期的腦保護作用，以及對腦缺血半暗帶中神經血管單元的整體保護作

3、用和機制，為將梓葛凍干粉針開發(fā)成治療缺血性腦中風的候選藥物提供基礎研究數(shù)據。
　　3.方法與結果
　　3.1梓葛凍干粉針對大鼠急性腦缺血損傷整體保護作用研究
　　方法用線栓法梗塞大腦中動脈，復制大鼠中風模型。在造模大鼠蘇醒2h后，采用改良神經功能缺損評分法（mNSS）進行評分并分組。以mNSS評分得4分及以上且各項均有缺損為標準，判定造模成功。將造模成功的64只大鼠隨機分為4個組，每組16只：模型組，梓葛凍干粉針65.

4、4 mg·kg-1、32.7 mg·kg-1和16.4 mg·kg-1組。另設假手術組16只。尾靜脈注射梓葛凍干粉針或生理鹽水，一天2次，給藥1天。
　　造模24 h后：
　?、儆胢NSS評分法再次評價大鼠的神經功能，并分析組間差異顯著性。
　　②每組取8只大鼠麻醉處死，分離新鮮大腦用腦模切片，作TTC染色，拍照后，用軟件測算腦梗死面積百分比，并分析比較組間差異顯著性。
　　③每組另取8只大鼠麻醉，灌流固定后分離

5、大腦，冰凍切片后作HE染色，用顯微鏡觀察并拍照，比較組間腦缺血半暗帶組織的損傷情況。
　　結果與假手術組相比，模型組大鼠mNSS得分和腦梗死面積百分比均顯著增加（p<0.01），缺血區(qū)腦組織大面積壞死，部分區(qū)皮質域呈高度疏松篩網狀結構，細胞結構不清，紅色壞死神經元顯著增加。與模型組相比，梓葛凍干粉針65.4 mg·kg-1、32.7 mg·kg-1和16.4 mg·kg-1組大鼠mNSS得分和腦梗死面積百分比均顯著下降(p<0.0

6、1、p<0.05)，缺血區(qū)腦組織壞死程度顯著減輕，紅色壞死神經元顯著減少。
　　3.2梓葛凍干粉針抗大鼠急性腦缺血損傷半暗帶保護機制研究
　　方法造模及分組給藥方法同第一章，每組12只大鼠。造模24 h后：
　?、倜拷M取6只大鼠，按第一章方法制作大腦冰凍切片，用TUNEL+特異性蛋白雙重免疫熒光染色標記腦片，熒光顯微鏡觀察缺血半暗帶大腦皮質區(qū)神經元、星形膠質細胞和微血管內皮細胞生長形態(tài)并拍照，用軟件分析3種細胞的凋亡率

7、，并比較組間差異顯著性。
　　②另取腦片，用免疫組化技術分別標記Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白，用顯微鏡觀察缺血半暗帶大腦皮質區(qū)并拍照。
　?、勖拷M另取6只大鼠麻醉取腦，提取缺血半暗帶大腦皮質組織勻漿蛋白，用WB檢測勻漿蛋白中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白表達，并分析比較組間差異顯著性。
　　結果與假

8、手術組相比，模型組大鼠缺血半暗帶大腦皮質層區(qū)域神經元、星形膠質細胞和微血管內皮細胞的凋亡率顯著增加(p<0.01)，細胞生長形態(tài)嚴重受損，促細胞凋亡的Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白表達均顯著增加(p<0.01)，抑制細胞凋亡的Bcl-2蛋白表達顯著減少(p<0.01)。與模型組相比，梓葛凍干粉針65.4 mg·kg-1、32.7 mg·kg-1和16.4 mg·kg-1組大鼠缺血半暗帶大腦

9、皮質區(qū)域該3種細胞的凋亡率均顯著降低(p<0.01)，其生長形態(tài)明顯改善，上述促調蛋白表達均顯著減少(p<0.01，p<0.05)；其中，梓葛凍干粉針65.4 mg·kg-1組大鼠Bcl-2蛋白表達顯著增加(p<0.01)。
　　3.3體外腦神經血管單元半暗帶損傷模型的建立及梓葛凍干粉針的整體保護作用研究
　　方法:
　　①大鼠大腦皮層神經元、星形膠質細胞和微血管內皮細胞的原代培養(yǎng)，以及由該3種細胞共培養(yǎng)組成的腦神經血

10、管單元模型的構建，均參照課題組前期方法。
　?、谟梦墨I報道的半暗帶條件培養(yǎng)液，對所建立的腦神經血管單元模型進行損傷，24 h后，以細胞生長狀態(tài)、數(shù)量、軸突長度和細胞跨內皮電阻值顯著（p＜0.05）低于正常培養(yǎng)孔為標準，判定體外腦神經血管單元半暗帶損傷模型構建成功。
　?、蹖嫿ǖ哪X神經血管單元模型隨機分為5個組，每組6個孔：正常培養(yǎng)組、損傷模型組（半暗帶條件培養(yǎng)液損傷24 h）、梓葛凍干粉針3個劑量組（于更換半暗帶條件培養(yǎng)液

11、時加入49.0μg·mL-1、24.5μg·mL-1以及12.25μg·mL-1的梓葛凍干粉針）。用藥24 h后，用顯微鏡觀察3種細胞的生長形態(tài)并拍照，用臺盼藍計數(shù)法檢測星形膠質細胞和微血管內皮細胞的活細胞數(shù)量，用圖像分析軟件測量神經元軸突長度，用細胞電阻儀檢測模型中跨內皮電阻值，并分析比較組間差異顯著性。
　　結果:
　?、俪晒Ψ蛛x培養(yǎng)出高純度的大鼠大腦皮層3種原代細胞，構建了由該3種細胞共培養(yǎng)的腦神經血管單元整體模型。與

12、單細胞培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)模型中神經元胞體圓潤且立體感強，軸突更粗大且長并形成致密網絡；腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞胞間接觸更緊密，形成致密的單層；腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞活細胞數(shù)量、神經元軸突長度以及模型跨內皮電阻值均顯著增加（p<0.05。p<0.01）。
　?、谂c正常培養(yǎng)組相比，經半暗帶條件培養(yǎng)液損傷的腦神經血管單元整體模型組中，神經元立體感較差，胞體和軸突變小，軸突網絡密度降低；腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞胞體收縮，

13、部分細胞出現(xiàn)脫落；腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞活細胞數(shù)量、神經元軸突長度以及跨內皮電阻值均顯著降低（p<0.01）。與半暗帶條件培養(yǎng)液損傷的腦神經血管單元整體模型組相比，梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1、24.5μg·mL-1以及12.25μg·mL-1組腦神經血管單元整體模型中，神經元胞體無明顯收縮，突觸網絡仍較緊密；微血管內皮細胞和星形膠質細胞胞體輕微收縮，胞間接觸仍較緊密；腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞活細胞數(shù)量、腦神經血管單

14、元整體跨內皮電阻值均顯著增加（p<0.01）；其中，梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1和24.5μg·mL-1組神經元軸突長度顯著增加（p<0.01）。
　　3.4梓葛凍干粉針抗體外腦神經血管單元模型半暗帶損傷的機制研究
　　方法①大鼠大腦皮層3種原代細胞的培養(yǎng)、腦神經血管單元模型的構建及體外腦神經血管單元模型半暗帶損傷方法同第3章。②將構建的腦神經血管單元模型隨機分為7個組，每組6孔：正常培養(yǎng)組：在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；損傷

15、模型組：半暗帶條件培養(yǎng)液損傷24 h；梓葛凍干粉針3個劑量組：在更換半暗帶條件培養(yǎng)液時添加梓葛凍干粉針，使其終濃度分別為49.0μg·mL-1、24.5μg·mL-1、12.25μg·mmL-1；抑制劑MG132組：在更換半暗帶條件培養(yǎng)液時添加MG132，使其終濃度為10μM；49.0μg·mmL-1梓葛凍干粉針+MG132組：在更換半暗帶條件培養(yǎng)液時，添加梓葛凍干粉針（49.0μg·mL-1）和MG132（10μM）。③用藥后，用流式

16、細胞儀檢測不同組別腦神經血管單元細胞共培養(yǎng)模型中3種細胞凋亡率，并分析比較組間差異顯著性。④用試劑盒提取不同組別腦神經血管單元模型細胞總蛋白，蛋白定量后，按WB操作步驟，檢測分析Bax、Bcl-2、Caspase3、Cleaved caspase-3、Caspase-9、Cleaved caspase-9、Cyt-C、XIAP的蛋白表達，并分析比較組間差異顯著性。
　　結果與正常培養(yǎng)組相比，經半暗帶條件培養(yǎng)液損傷的腦神經血管單元模

17、型組中，神經元、星形膠質細胞和微血管內皮細胞凋亡率均顯著增加（p<0.01），細胞Bax、Cyt-C、 Cleaved caspase-9、Caspase-3和Cleaved caspase-3蛋白表達均顯著增加（p<0.01），Bcl-2和XIAP蛋白表達顯著降低（p<0.01）。與半暗帶條件培養(yǎng)液損傷的腦神經血管單元整體模型組相比，梓葛凍干粉針49.0μg.mL-1及24.50μg.mL-1組該3種細胞的凋亡率均顯著降低（p<0.0

18、1），Cyt-C、Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3的蛋白表達均顯著降低（p<0.01），Bcl-2和XIAP的蛋白表達均顯著升高（p<0.01），其中梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1組Bax蛋白表達顯著降低（p<0.01）。與梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1組相比，MG132+梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1組XIAP蛋白與Cleaved caspase-3蛋白表達均顯著增加（p<0.01，p

19、<0.05）。
　　4.研究結論
　　4.1梓葛凍干粉針能減輕大鼠腦缺血區(qū)域受損細胞形態(tài)變化，減少細胞死亡，減少缺血區(qū)腦組織梗死灶面積，改善大鼠神經功能，對大鼠急性腦缺血損傷發(fā)揮整體保護作用。
　　4.2梓葛凍干粉針對大鼠急性腦缺血損傷的整體保護作用，主要是通過抑制缺血半暗帶區(qū)神經元、星形膠質細胞和微血管內皮細胞凋亡實現(xiàn)的，其機制與調節(jié)線粒體凋亡通路有關。
　　4.3梓葛凍干粉針對急性腦缺血半暗帶神經血管單元細胞