梓醇對(duì)腦缺血的神經(jīng)血管保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的: (1)觀察梓醇對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株細(xì)胞黏附、增殖、遷移等行為的影響，觀測(cè)其對(duì)大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元存活以及軸突生長(zhǎng)的作用，了解梓醇對(duì)HUVECs細(xì)胞表達(dá)紅細(xì)胞生成素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白的影響，從細(xì)胞生物學(xué)角度驗(yàn)證梓醇是否能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元生長(zhǎng)，并探討其可能機(jī)制； (2)觀察腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)變化及梓醇的影響，考察梓醇對(duì)腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷闹饕幮W(xué)結(jié)果； (3)觀察梓醇對(duì)腦缺血后血管新生和神經(jīng)元軸

2、突芽生的作用，了解梓醇對(duì)腦缺血后GAP-43、VEGF和EPO蛋白表達(dá)的影響，從腦缺血后血管新生和軸突芽生角度研究梓醇對(duì)腦缺血的治療作用，并從神經(jīng)、血管生長(zhǎng)促進(jìn)因子層面探討其作用機(jī)制； (4)初步了解轉(zhuǎn)錄因子STAT3在腦缺血后血管新生中的作用，觀察梓醇對(duì)腦缺血后STAT3磷酸化水平的影響，進(jìn)一步從基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平探討梓醇促腦缺血后血管新生作用的機(jī)制。 方法: (1)培養(yǎng)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株和大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元，

3、采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT法、劃痕實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞黏附率、增殖能力和遷移距離；培養(yǎng)大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元，采用MTT法和測(cè)微尺測(cè)定神經(jīng)元生存活力和軸突長(zhǎng)度；采用免疫酶組織化學(xué)染色，原位檢測(cè)HUVECs細(xì)胞EPO和VEGF蛋白表達(dá)； (2)制備局灶永久性腦缺血大鼠模型，從神經(jīng)行為學(xué)角度評(píng)價(jià)梓醇治療腦缺血的藥效、有效給藥時(shí)間窗及有效劑量；采用高效液相色譜技術(shù)，定性檢測(cè)梓醇能否通過(guò)血腦屏障； (3)采用熒光單/雙標(biāo)記以及免疫酶組化染色

4、，檢測(cè)微血管密度和新生微血管數(shù)目，以及神經(jīng)元軸突芽生分子標(biāo)志GAP-43表達(dá)變化，評(píng)價(jià)梓醇對(duì)腦缺血后血管新生和神經(jīng)元軸突芽生是否有促進(jìn)作用； (4)采用神經(jīng)超微病理技術(shù)，觀察梓醇對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響； (5)采用免疫組化和Western blot免疫印跡分析法，原位檢測(cè)和半定量分析各實(shí)驗(yàn)組腦組織內(nèi)EPO和VEGF蛋白表達(dá)的變化； (6)使用AG490抑制STAT3磷酸化，采用免疫酶組化染色和熒

5、光雙標(biāo)技術(shù)觀察STAT3核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象和血管新生的變化，采用Westernblot分析了解STAT3磷酸化水平和VEGF蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果: 一、離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.當(dāng)梓醇終濃度為0.25mg·ml<'-1>時(shí)，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性地促進(jìn)HUVECs黏附效應(yīng)。 2.梓醇上調(diào)HUVECs細(xì)胞表達(dá)EPO和VEGF蛋白梓醇終濃度為0.5、1、2.5mg·ml<'-1>時(shí)，梓醇組 EPO 陽(yáng)性細(xì)胞光密度值均明顯高于空白對(duì)

6、照組和生理鹽水對(duì)照組，梓醇終濃度為0.5、1、2.5、5mg·ml<'-1>時(shí)，梓醇組 VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞光密度值明顯高于空白對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組。 3.梓醇促進(jìn)原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)原代培養(yǎng)并采用NF-200抗原鑒定神經(jīng)元，純度達(dá)95％以上。梓醇終濃度為1、2.5和5 mg·ml<'-1>時(shí)，可明顯促進(jìn)神經(jīng)元軸突延伸。梓醇對(duì)神經(jīng)元生存活性無(wú)明顯影響。 二、在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.梓醇促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)缺失功能

7、恢復(fù)采用Bederson神經(jīng)功能評(píng)分、肌力評(píng)定、平衡木行走試驗(yàn)和左前肢食物抓取功能測(cè)定等多種方法評(píng)定腦缺血后1、4、7、15和21天各實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)缺失功能恢復(fù)狀況，證實(shí)梓醇對(duì)腦缺血后功能恢復(fù)有促進(jìn)作用。在腦缺血后21天，梓醇中、高劑量組受累前肢(左)食物抓取成功率分別為48.7％±5.4％和47.3％±4.8％，與模型組比較差異具有顯著性。且腦缺血后21天時(shí)，術(shù)后6h開(kāi)始給藥組和術(shù)后24h開(kāi)始給藥組左前肢食物抓取成功率差異無(wú)顯著性。

8、 2.梓醇能夠通過(guò)血腦屏障給藥后40min的大鼠腦脊液，HPLC法檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間為10.4min處可見(jiàn)梓醇的紫外吸收峰，與腦脊液加樣對(duì)照梓醇的紫外吸收峰保留時(shí)間相同。 3.梓醇促進(jìn)腦缺血后血管新生 (1)大腦整體標(biāo)本表面血管像特征腦缺血后15天，模型組可見(jiàn)邊沿清晰的腦組織液化、壞死灶，腦表面血管分枝數(shù)目稀少，排列紊亂。而梓醇治療組病灶基本愈合，腦表面血管分枝數(shù)目比模型組明顯增加，大部分分枝跨越病灶表面，呈輻射狀

9、排列向病灶部位聚集。 (2)激光共聚焦顯示缺血周圍區(qū)新生血管免疫熒光雙標(biāo)共定位圖像顯示，新生血管呈臘腸樣結(jié)構(gòu)，部分可見(jiàn)分枝。部分新生血管之間靠攏形成連接。模型組缺血灶周圍大腦皮質(zhì)可見(jiàn)管腔大、管壁薄的血管生成。新生的小血管向缺血病灶區(qū)輻射狀移行長(zhǎng)入，但分枝數(shù)目較少。梓醇組新生血管管腔比模型組小，分枝點(diǎn)增多。 (3)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化特征模型組缺血側(cè)微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)以及毛細(xì)血管周圍高度水腫，電子密度淺，血管內(nèi)皮細(xì)

10、胞內(nèi)線粒體數(shù)目減少，線粒體的大部分嵴融合消失，部分核膜融合消失。梓醇中劑量組和胞磷膽堿組：鏡下表現(xiàn)較模型組均有明顯改善，毛細(xì)血管周圍水腫較模型組輕，基膜基本正常，血管內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)較多的線粒體，已接近正常狀態(tài)。初步印象以梓醇中劑量組對(duì)內(nèi)皮水腫改善最為顯著。 4.梓醇對(duì)腦缺血后神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)和突觸超微結(jié)構(gòu)的影響 (1)梓醇對(duì)腦缺血后軸突生長(zhǎng)標(biāo)志物GAP-43蛋白表達(dá)的影響免疫熒光組化染色顯示，腦缺血后 15 天，模型組和生理

11、鹽水組GAP-43陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度值分別為162.25±12.33和141.98±10.94，與假手術(shù)組127.45±3.7相比較，差異無(wú)顯著性。梓醇中劑量治療組累積光密度值為359.24±12.38，較模型組、生理鹽水組和胞磷膽堿組增加，差異具有顯著性。Western Blot半定量分析與免疫熒光原位檢測(cè)結(jié)果相符。 (2)梓醇對(duì)神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)的影響模型組缺血側(cè)水腫重，突觸前、后膜薄，溶解，突觸后結(jié)構(gòu)腫脹明顯，電子密度淺，

12、突觸數(shù)目減少；梓醇組突觸數(shù)目較模型組明顯增多，突觸后膜電子密度接近正常，突觸病變較輕。 5.腦缺血后15天，模型組和生理鹽水對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞累積光密度值分別為4.80±0.41和5.02±0.60，均明顯高于假手術(shù)組，梓醇中劑量組累積光密度值為9.43±1.27，顯著高于模型組、生理鹽水對(duì)照組和胞磷膽堿組，差異具有顯著性；Western Blot半定量分析結(jié)果與EPO原位檢測(cè)結(jié)果相符。 6.梓醇對(duì)腦缺血后VEGF蛋白表達(dá)的

13、影響模型組陽(yáng)性細(xì)胞累積光密度值為325.10±26.82，比假手術(shù)組增加，差異具有顯著性，提示腦缺血后VEGF的表達(dá)水平上調(diào)；梓醇組累積光密度值比其它實(shí)驗(yàn)組均明顯增加，且差異具有顯著性；Western blot 半定量分析結(jié)果與上述結(jié)果一致。 7.梓醇對(duì)腦缺血后KDR蛋白表達(dá)的影響假手術(shù)組陽(yáng)性細(xì)胞平均累積光密度值為47.95±5.78，而模型組為69.99±6.59，顯著高于假手術(shù)組，梓醇組陽(yáng)性細(xì)胞平均累積光密度值為116.3±

14、10.23，比模型組和胞二磷膽堿組均明顯增加；Western blot 分析也顯示，梓醇組相對(duì)IOD值比其它實(shí)驗(yàn)組均明顯增高，與組化結(jié)果一致。 8.STAT3信號(hào)在腦缺血后血管新生中的作用及梓醇對(duì)其影響 (1)磷酸化-STAT3 蛋白表達(dá)原位檢測(cè)結(jié)果免疫組化顯微圖像分析顯示，模型組P-STAT3陽(yáng)性細(xì)胞累積光密度值(IOD)較假手術(shù)組明顯增加，AG490組 p-STAT3 陽(yáng)性細(xì)胞IOD值為12.8±1.5，明顯比模型組

15、42.38±2.55低，AG490 與梓醇聯(lián)合干預(yù)后，陽(yáng)性細(xì)胞IOD值為56.22+4.25，比AG490組明顯增加；且梓醇組IOD值為86.89±5.32，明顯高于與模型組，Western blot檢測(cè)各組磷酸化STAT3蛋白表達(dá)與組化結(jié)果一致。 (2)STAT3蛋白磷酸化率比較結(jié)果各實(shí)驗(yàn)組磷酸化STAT3與總STAT3蛋白條帶IOD值的比值經(jīng)內(nèi)參β-actin校正后反映各組STAT3蛋白磷酸化率。 (3)VEGF蛋白

16、表達(dá)水平比較結(jié)果免疫熒光圖像分析結(jié)果顯示，梓醇組IOD值明顯高于模型組，聯(lián)合使用梓醇和 AG490干預(yù)后，VEGF表達(dá)水平較單用AG490組升高，梓醇部分抵消了 AG490 對(duì) VEGF蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)。Western blot檢測(cè)結(jié)果與此一致。 (4)新生微血管相關(guān)參數(shù)比較結(jié)果IPP 圖像分析軟件分析共定位圖像，梓醇可能增強(qiáng)STAT3的活化水平而發(fā)揮其促進(jìn)腦缺血后血管新生效應(yīng)。 結(jié)論： 1．梓醇具有減輕局灶永

17、久性腦缺血大鼠腦血管內(nèi)皮水腫、改善神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的藥效，6h和24h給藥均有治療作用，具有較長(zhǎng)的治療時(shí)間窗；1、5、10 mg·kg<'-1>均有治療作用，5mg·kg<'-1>體重劑量療效果最佳； 2．梓醇的腦保護(hù)作用具有多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。其作用機(jī)制與以下途徑有關(guān)： (1)梓醇能夠通過(guò)血腦屏障； (2)梓醇減輕腦微血管內(nèi)皮水腫，增加神經(jīng)元突觸數(shù)目，梓醇可干預(yù)神經(jīng)血管可塑性調(diào)節(jié)； (3)梓醇促進(jìn)多效性