梓葛凍干粉針對腦缺血大鼠內皮祖細胞及HUVEC增殖的影響.pdf

1、背景：
　　 梓葛凍干粉針為本實驗室自主創(chuàng)制的抗腦缺血卒中的中藥復方新藥，由《千金方》中治療中風著名方劑羌活湯主要成分梓醇和葛根素組成，其處方與制備工藝已經申報國家技術發(fā)明專利（公開號CN101574361A），制備工藝、質量標準和穩(wěn)定性研究獲得教育部基金(XDJK2009C084)資助，主要藥效學研究獲得重慶市科技攻關項目基金(CSTC，2010AC5011)資助，其對“腦血管神經單元”的保護作用研究獲得西南大學研究生科技創(chuàng)新

2、基金(Ky200901)資助。本課題組主要從缺血后神經功能恢復，腦梗死面積減少，血管新生、血管擴張，腦血流恢復，腦血管與神經細胞關系等方面進行研究。
　　 缺血性腦卒中是一個復雜的病理過程，涉及到自由基損傷、能量代謝障礙、炎癥反應、細胞凋亡等方面。血管內皮細胞是缺血損傷中自由基和多種損傷性因子作用的重要靶點，血管內皮細胞受損活化是缺血損傷病理演變過程中的關鍵環(huán)節(jié)。
　　 中風作為嚴重危害人類健康的第三大致死疾病，迄今為止

3、，臨床上沒有理想的辦法恢復中風后丟失的神經功能。要重建受損的神經網絡必須尋找新的替代“元件”，如新的神經細胞、新的血管、新的突觸以及新的電興奮連接。而干細胞因其良好的增殖和分化潛能，成為中風后細胞缺失替代良好的細胞來源。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是源于骨髓的另一類成體干細胞，在治療性血管再生中起了重要的作用。體外擴增EPCs再自體移植可能是治療腦缺血的一個新穎有效的策略，研究梓葛凍干

4、粉針對腦缺血大鼠內皮祖細胞和內皮細胞增殖的作用非常必要。
　　 目的：
　　 (1)觀察梓葛凍干粉針對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)正常及缺氧/復氧損傷環(huán)境下增殖的影響，并初步探討其可能的損傷保護機制;
　　 (2)觀察梓葛凍干粉針對大鼠骨髓來源內皮祖細胞(EPCs)正常及缺氧/復氧損傷環(huán)境下增殖的影響;
　　 (3)采用電凝

5、法制備腦缺血大鼠模型，研究梓葛凍干粉針對腦缺血大鼠的神經功能保護作用，尤其是是否具有促進內皮祖細胞增殖的作用，為其新藥創(chuàng)制提供依據。
　　 方法：
　　 (1)體外培養(yǎng)HUVECs，MTT法觀察梓葛凍干粉針對其增殖的影響;通過采用Krebs液建立缺氧/復氧損傷模型，用梓葛凍干粉針干預后，采用MTT法測定細胞活力、2，4-二硝基苯肼顯色法測定細胞外乳酸脫氫酶(LDH)釋放量、黃嘌呤氧化酶法測定細胞內超氧化物歧化酶(SOD)

6、活性、硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛(MDA)含量、硝酸還原酶法測定一氧化氮(NO)含量;Westernblot法考察細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達。
　　 (2)本課題采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法相結合，使用專用培養(yǎng)基EGM-2，成功分離純化EPCs，通過形態(tài)學，細胞表面分子標志物檢測，內皮祖細胞吞噬功能對其進行鑒定;MTT比色法觀察梓葛凍干粉針對其正常及缺氧/復氧損傷環(huán)境下增殖的影響及其保護作用

7、。
　　 (3)采用電凝法阻斷大鼠大腦中動脈建立局部腦缺血模型，通過神經行為學Longa評分、平衡木評分，研究梓葛凍干粉針對腦缺血大鼠的神經功能保護作用。通過流式細胞儀檢測梓葛凍干粉針對腦缺血大鼠外周血中EPCs增殖的實驗研究。
　　 結果：
　　 1.梓葛凍干粉針對HUVECs增殖及其缺氧/復氧損傷的離體實驗研究
　　 正常培養(yǎng)條件下，梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1、24.5μg·mL-1能夠顯著

8、促進HUVECs的增殖（P＜0.01）;缺氧/復氧損傷培養(yǎng)條件下，與模型組相比，梓葛凍干粉針12.5μg·mL-1顯著提高HUVECs活力(P＜0.05);梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1，24.5μg·mL-1，12.5μg·mL-1均顯著提高缺氧/復氧后HUVECsSOD活性(P＜0.05);梓葛凍干粉針24.5μg·mL-1，12.5μg·mL-1能顯著減少LDH的釋放量及降低MDA和NO的含量(P＜0.05)，并上調HUVEC

9、sBcl-2蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01）;梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1，24.5μg·mL-1，12.5μg·mL-1顯著降低Bax的表達并上調Bcl-2/Bax(P＜0.05，P＜0.01)，且梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1，24.5μg·mL-1顯著降低Caspase-3的表達(P＜0.01)。
　　 2.梓葛凍干粉針對大鼠骨髓來源EPCs增殖的離體實驗研究
　　 成功分離純化EPCs，并對形態(tài)學

10、鑒定，細胞表面分子標志物檢測，內皮祖細胞吞噬功能等鑒定方法呈陽性。正常培養(yǎng)條件下，梓葛凍干粉針24.5μg·mL-1能夠顯著促進EPCs的增殖(P＜0.05);缺氧/復氧條件下，梓葛凍干粉針98.0μg·mL-1、49.0μg·mL-1能夠顯著促進EPCs的增殖(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 3.梓葛凍干粉針對腦缺血大鼠神經功能及外周血中EPCs增殖的實驗研究
　　 與假手術組相比，模型組與各藥物組大鼠出現前肢卷

11、曲、不平穩(wěn)，前肢或后肢滑落等癥狀。與模型組相比，缺血第4、7天后，梓葛凍干粉針組神經行為學分值顯著降低（P＜0.05）;缺血第1、7天后，梓葛凍干粉針組平衡木行走分值均顯著降低（P＜0.05）;65.4mg·kg-1梓葛凍干粉針能夠提高腦缺血大鼠外周血中EPCs的數量。
　　 結論：
　　 1.梓葛凍干粉針能夠顯著促進正常及缺氧/復氧培養(yǎng)條件下HUVECs增殖，并可顯著拮抗缺氧/復氧對HUVECs的損傷，可能與其抑制細胞