梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞及HUVEC增殖的影響.pdf

1、背景：
　　 梓葛凍干粉針為本實(shí)驗(yàn)室自主創(chuàng)制的抗腦缺血卒中的中藥復(fù)方新藥，由《千金方》中治療中風(fēng)著名方劑羌活湯主要成分梓醇和葛根素組成，其處方與制備工藝已經(jīng)申報(bào)國(guó)家技術(shù)發(fā)明專利（公開(kāi)號(hào)CN101574361A），制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性研究獲得教育部基金(XDJK2009C084)資助，主要藥效學(xué)研究獲得重慶市科技攻關(guān)項(xiàng)目基金(CSTC，2010AC5011)資助，其對(duì)“腦血管神經(jīng)單元”的保護(hù)作用研究獲得西南大學(xué)研究生科技創(chuàng)新

2、基金(Ky200901)資助。本課題組主要從缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)，腦梗死面積減少，血管新生、血管擴(kuò)張，腦血流恢復(fù)，腦血管與神經(jīng)細(xì)胞關(guān)系等方面進(jìn)行研究。
　　 缺血性腦卒中是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，涉及到自由基損傷、能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面。血管內(nèi)皮細(xì)胞是缺血損傷中自由基和多種損傷性因子作用的重要靶點(diǎn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損活化是缺血損傷病理演變過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　 中風(fēng)作為嚴(yán)重危害人類健康的第三大致死疾病，迄今為止

3、，臨床上沒(méi)有理想的辦法恢復(fù)中風(fēng)后丟失的神經(jīng)功能。要重建受損的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)必須尋找新的替代“元件”，如新的神經(jīng)細(xì)胞、新的血管、新的突觸以及新的電興奮連接。而干細(xì)胞因其良好的增殖和分化潛能，成為中風(fēng)后細(xì)胞缺失替代良好的細(xì)胞來(lái)源。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是源于骨髓的另一類成體干細(xì)胞，在治療性血管再生中起了重要的作用。體外擴(kuò)增EPCs再自體移植可能是治療腦缺血的一個(gè)新穎有效的策略，研究梓葛凍干

4、粉針對(duì)腦缺血大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用非常必要。
　　 目的：
　　 (1)觀察梓葛凍干粉針對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)正常及缺氧/復(fù)氧損傷環(huán)境下增殖的影響，并初步探討其可能的損傷保護(hù)機(jī)制;
　　 (2)觀察梓葛凍干粉針對(duì)大鼠骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)正常及缺氧/復(fù)氧損傷環(huán)境下增殖的影響;
　　 (3)采用電凝

5、法制備腦缺血大鼠模型，研究梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血大鼠的神經(jīng)功能保護(hù)作用，尤其是是否具有促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的作用，為其新藥創(chuàng)制提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 (1)體外培養(yǎng)HUVECs，MTT法觀察梓葛凍干粉針對(duì)其增殖的影響;通過(guò)采用Krebs液建立缺氧/復(fù)氧損傷模型，用梓葛凍干粉針干預(yù)后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力、2，4-二硝基苯肼顯色法測(cè)定細(xì)胞外乳酸脫氫酶(LDH)釋放量、黃嘌呤氧化酶法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)

6、活性、硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定丙二醛(MDA)含量、硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮(NO)含量;Westernblot法考察細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)。
　　 (2)本課題采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，使用專用培養(yǎng)基EGM-2，成功分離純化EPCs，通過(guò)形態(tài)學(xué)，細(xì)胞表面分子標(biāo)志物檢測(cè)，內(nèi)皮祖細(xì)胞吞噬功能對(duì)其進(jìn)行鑒定;MTT比色法觀察梓葛凍干粉針對(duì)其正常及缺氧/復(fù)氧損傷環(huán)境下增殖的影響及其保護(hù)作用

7、。
　　 (3)采用電凝法阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈建立局部腦缺血模型，通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)Longa評(píng)分、平衡木評(píng)分，研究梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血大鼠的神經(jīng)功能保護(hù)作用。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血大鼠外周血中EPCs增殖的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 結(jié)果：
　　 1.梓葛凍干粉針對(duì)HUVECs增殖及其缺氧/復(fù)氧損傷的離體實(shí)驗(yàn)研究
　　 正常培養(yǎng)條件下，梓葛凍干粉針12.25μg·mL-1、24.5μg·mL-1能夠顯著

8、促進(jìn)HUVECs的增殖（P＜0.01）;缺氧/復(fù)氧損傷培養(yǎng)條件下，與模型組相比，梓葛凍干粉針12.5μg·mL-1顯著提高HUVECs活力(P＜0.05);梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1，24.5μg·mL-1，12.5μg·mL-1均顯著提高缺氧/復(fù)氧后HUVECsSOD活性(P＜0.05);梓葛凍干粉針24.5μg·mL-1，12.5μg·mL-1能顯著減少LDH的釋放量及降低MDA和NO的含量(P＜0.05)，并上調(diào)HUVEC

9、sBcl-2蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）;梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1，24.5μg·mL-1，12.5μg·mL-1顯著降低Bax的表達(dá)并上調(diào)Bcl-2/Bax(P＜0.05，P＜0.01)，且梓葛凍干粉針49.0μg·mL-1，24.5μg·mL-1顯著降低Caspase-3的表達(dá)(P＜0.01)。
　　 2.梓葛凍干粉針對(duì)大鼠骨髓來(lái)源EPCs增殖的離體實(shí)驗(yàn)研究
　　 成功分離純化EPCs，并對(duì)形態(tài)學(xué)

10、鑒定，細(xì)胞表面分子標(biāo)志物檢測(cè)，內(nèi)皮祖細(xì)胞吞噬功能等鑒定方法呈陽(yáng)性。正常培養(yǎng)條件下，梓葛凍干粉針24.5μg·mL-1能夠顯著促進(jìn)EPCs的增殖(P＜0.05);缺氧/復(fù)氧條件下，梓葛凍干粉針98.0μg·mL-1、49.0μg·mL-1能夠顯著促進(jìn)EPCs的增殖(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 3.梓葛凍干粉針對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能及外周血中EPCs增殖的實(shí)驗(yàn)研究
　　 與假手術(shù)組相比，模型組與各藥物組大鼠出現(xiàn)前肢卷

11、曲、不平穩(wěn)，前肢或后肢滑落等癥狀。與模型組相比，缺血第4、7天后，梓葛凍干粉針組神經(jīng)行為學(xué)分值顯著降低（P＜0.05）;缺血第1、7天后，梓葛凍干粉針組平衡木行走分值均顯著降低（P＜0.05）;65.4mg·kg-1梓葛凍干粉針能夠提高腦缺血大鼠外周血中EPCs的數(shù)量。
　　 結(jié)論：
　　 1.梓葛凍干粉針能夠顯著促進(jìn)正常及缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)條件下HUVECs增殖，并可顯著拮抗缺氧/復(fù)氧對(duì)HUVECs的損傷，可能與其抑制細(xì)胞