靶向上調(diào)肝細(xì)胞CGRP受體對(duì)肝細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的:肝臟缺血再灌注損傷是臨床工作中面的一項(xiàng)嚴(yán)重問題，是導(dǎo)致肝切除、肝外傷、肝移植以及體循環(huán)障礙后肝臟損傷和肝移植失敗的主要原因。降鈣素基因相關(guān)肽是含有37個(gè)氨基酸殘基的神經(jīng)肽，其具有功能強(qiáng)大的擴(kuò)張血管和免疫調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也可對(duì)多種器官的缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建肝臟缺血-再灌注損傷的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⑸险{(diào)肝細(xì)胞的CGRP受體蛋白表達(dá)，探討外源性降鈣素基因相關(guān)肽及其受體對(duì)肝細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行

2、研究。
　　方法:HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照(NC)組、缺氧-復(fù)氧(H-R)組、CGRP處理(H-R+50nM CGRP)組。對(duì)各組細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)，如丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、還原型谷胱甘肽(GSH)的含量進(jìn)行檢測(cè)、使用western blot對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表達(dá)含量進(jìn)行檢測(cè)、并對(duì)細(xì)胞上清中乳酸脫氫酶(LDH)的活性和使用CCK-8試劑對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)

3、行檢測(cè)。使用不同病毒滴度的重組慢病毒-CGRP受體基因載體對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行感染，從而確定病毒基因載體感染的最佳感染復(fù)數(shù)值。以最佳感染復(fù)數(shù)值的病毒基因載體對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行感染，使用Western blot對(duì)CGRP受體蛋白CRLR的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)病毒基因載體成功上調(diào)CGRP受體蛋白表達(dá)后，在缺氧-復(fù)氧模型中加入高濃度的CGRP，使用CCK-8試劑對(duì)肝細(xì)胞的存活率進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:與正常培養(yǎng)細(xì)胞相比，缺氧-復(fù)氧模型可

4、誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激損傷，MDA含量明顯升高，SOD活性明顯降低，GSH含量顯著降低;細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2蛋白含量降低，Bax蛋白含量升高;細(xì)胞上清中LDH活性升高，細(xì)胞存活率明顯降低(p＜0.05)。缺氧-復(fù)氧模型中加入CGRP處理后細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷明顯緩解，細(xì)胞凋亡明顯減少，細(xì)胞上清中LDH活性明顯降低，細(xì)胞存活率明顯升高(p＜0.05)。但是，由于配體受體結(jié)合存在飽和性，限制了外源性CGRP對(duì)肝細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)

5、作用。以最佳感染復(fù)數(shù)值MOI=10對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行慢病毒-CGRP受體基因載體感染，使用Western blot對(duì)CGRP受體蛋白CRLR的表達(dá)含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其表達(dá)含量明顯升高(p＜0.05)。成功上調(diào)肝細(xì)胞CGRP受體蛋白后并使用高濃度的CGRP對(duì)缺氧-復(fù)氧模型中的肝細(xì)胞進(jìn)行處理，CCK-8試劑對(duì)肝細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)結(jié)果顯示肝細(xì)胞存活率再次明顯升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:外源性CGRP可以通過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞