胰島素對LPS誘導的人肝細胞損傷的保護作用.pdf

1、目的：嚴重創(chuàng)傷、全身感染、肝病以及眾多的危重疾病在其發(fā)生發(fā)展過程中都可發(fā)生腸源性內(nèi)毒素血癥，損傷肝細胞，引發(fā)肝衰竭。臨床研究發(fā)現(xiàn)，對于重癥監(jiān)護、燒傷、膿毒血癥及感染性休克等危重疾病患者給予胰島素強化治療可改善病人癥狀，降低病人死亡率及其合并癥的發(fā)生率，但其作用機制尚不清楚。本實驗探討胰島素對于內(nèi)毒素血癥中肝細胞損傷的保護作用及其可能的作用機制，期望為臨床上肝病治療研究提供新的思路。 方法：①設正常對照組及10，20，40，80μ

2、g/ml四個LPS濃度組，各濃度設12，24，36，48 h四個干預時間，采用MTT比色法對各LPS損傷濃度和作用時間進行篩選。②設正常對照組、LPS損傷組(20μg/ml)、不同濃度(2.5，5，10，20 IU/ml)的胰島素保護組及對照組，各濃度設12，24，36，48 h四個干預時間，采用MTT比色法對各組細胞的存活率進行檢測。③Annexin—V/PI雙染法檢測正常對照組、LPS損傷組(20μg/ml)、不同濃度的胰島素(2.

3、5，5，10，20 IU/ml)保護組各組24 h細胞凋亡率。④實時定量PCR檢測正常對照組、LPS損傷組(20μg/ml)、不同濃度(2.5，5，10，20 IU/ml)的胰島素保護組凋亡相關基因bcl—2，bax和凋亡相關蛋白Caspase—3的基因表達情況。 結(jié)果：⑴經(jīng)MTT比色法檢測，LPS對HL7702細胞具有損傷作用，其誘導的細胞存活率的降低具有劑量和時間依賴性。10，20，40，80μg/ml LPS處理12，24

4、，36，48 h后與正常對照組相比，細胞存活率均有顯著性差異(P<0.01)。而加入2.5，5，10，20 IU/ ml胰島素共同培養(yǎng)12，24，36，48 h后，可減少細胞死亡率，提高細胞存活率，各濃度及各作用時間與20μg/ml LPS損傷組相比，有顯著性差異(P<0.01)。⑵Annexin—V/PI雙染法檢測細胞凋亡率結(jié)果顯示，20μg/ml LPS處理24 h后，凋亡細胞的比例為28.83±1.32％，與正常對照組9.38±0

5、.39％相比是增加的(P<0.01)，而加入2.5，5，10，20 IU/ml胰島素處理后，凋亡細胞比例分別降至：23.33±1.15％，20.76±1.21％，14.61±0.91％和12.30±1.23％，與20μg/ml LPS損傷組相比有顯著性差異(P<0.01)。⑶實時定量RT-PCR結(jié)果顯示，20μg/ml LPS處理24 h后，與正常對照組相比，細胞的bcl—2 mRNA表達(0.56±0.12)顯著降低(P<0.01)，

6、bax mRNA表達(1.37±0.08)和Caspase—3 mRNA表達(0.95±0.10)顯著升高(P<0.01)。胰島素可減輕bcl—2 mRNA表達下降與bax，Caspase—3 mRNA表達升高的程度，且這種影響呈劑量依賴性。經(jīng)2.5，5，10，20 IU/ml胰島素處理后，細胞bcl—2 mRNA表達分別增至：0.76±0.10，0.89±0.08，1.01±0.17和1.20±0.14；bax mRNA表達分別降至：

7、1.21±0.16，1.02±0.10，0.91±0.06和0.78±0.05；Caspase—3 mRNA表達分別降至：0.81±0.05，0.72±0.04，0.58±0.38和0.49±0.05，除外2.5 IU/ml胰島素保護組外，其他劑量胰島素保護組基因的表達與20μg/ml LPS損傷組相比均有顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論：①LPS可以損傷體外培養(yǎng)的人正常肝細胞HL7702細胞并誘導其凋亡。②胰島素能抑制LPS