黃連對LPS誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、嚴(yán)重的創(chuàng)傷、感染可導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)失控，最終引發(fā)內(nèi)毒素血癥及肝功能衰竭。研究表明，黃連（Rhizoma Coptis，RC）具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、止痛、降血糖、保肝解毒等諸多生物學(xué)活性，但其對LPS引起的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)及其作用機(jī)制尚未見報道。故本試驗以黃連（RC）水提物為試驗藥物、地塞米松（Dexamethasone，DEX）為陽性對照藥物、體外培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞（BRL cells）為靶細(xì)胞，采用脂多糖（LPS）構(gòu)建肝細(xì)胞損

2、傷模型后，進(jìn)行以下幾方面的研究：CCK-8法篩選RC的無毒濃度及LPS的損傷濃度，CCK-8法檢測RC與LPS共同作用于BRL細(xì)胞24 h時細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測BRL細(xì)胞凋亡率，RT-PCR檢測TLR4上的NF-κB、IRF3兩條信號傳導(dǎo)通路上mRNA相對表達(dá)量變化，熒光倒置顯微鏡觀察NF-κB p65蛋白核轉(zhuǎn)移等。結(jié)果如下：
　?。?）篩選RC的無毒濃度及LPS的損傷濃度：RC的無毒濃度為0.175 mg/mL， LPS的

3、損傷濃度為0.1 mg/mL；同時發(fā)現(xiàn)，RC濃度在0.0625~0.125 mg/mL時對BRL細(xì)胞有促增值作用。經(jīng)再次篩選，認(rèn)為0.1 mg/mL RC促增殖作用最好。
　?。?）RC與LPS共同作用于BRL細(xì)胞24 h時細(xì)胞存活率檢測：CCK-8結(jié)果表明，與LPS處理組相比，RC在0.175 mg/mL時能使BRL細(xì)胞存活率從73.79％增加至81.62%；0.1 mg/mL時能使BRL細(xì)胞存活率升高至91.23%。即RC濃度

4、為0.1 mg/mL時，保護(hù)作用較好。
　?。?）細(xì)胞凋亡率檢測：BRL細(xì)胞正常對照組、LPS處理組、0.175 mg/mL RC+LPS干預(yù)組、0.1 mg/mL RC+LPS干預(yù)組、0.0001 mg/mL Dex+LPS陽性對照組的總凋亡率（%）分別為：0.32±0.04、19.26±0.65、16.43±0.73、9.33±0.47、6.34±0.43。RC干預(yù)組與LPS處理組比較，細(xì)胞總凋亡率顯著下降（p<0.01），其

5、中，RC為0.1 mg/mL能使BRL細(xì)胞凋亡率由19.26%降低至9.33%?？梢奟C能有效抑制LPS誘導(dǎo)的BRL細(xì)胞凋亡，且RC在0.1 mg/mL時效果更好。
　?。?）熒光定量PCR檢測：與正常對照組相比，LPS處理組可使TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IRF3 mRNA的表達(dá)顯著上升（p<0.05），說明LPS誘導(dǎo)的損傷通過TLR4/NF-κB通路和TLR4/IRF3通路，最終導(dǎo)致炎性因子IL-1

6、β、IL-6、TNF-α釋放，從而損傷肝細(xì)胞；與LPS處理組相比，RC干預(yù)組均可抑制上述基因表達(dá)上調(diào)（p<0.05），對肝細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用，其機(jī)制與TLR4/NF-κB通路和TLR4/IRF3通路有關(guān)。
　?。?）免疫熒光檢測：BRL細(xì)胞正常對照組中，F(xiàn)ITC標(biāo)記的NF-κB p65蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，顯現(xiàn)綠色熒光，DAPI染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光；LPS處理的BRL細(xì)胞，胞質(zhì)中綠色熒光減弱，胞核顏色由深藍(lán)色變?yōu)闇\綠色；經(jīng)R

7、C處理后，BRL細(xì)胞核顏色變?yōu)椴煌潭鹊乃{(lán)綠色。該結(jié)果表明，在LPS作用下部分NF-κB p65蛋白由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞核，而RC干預(yù)組均可不同程度的抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65核轉(zhuǎn)移，且RC在0.1 mg/mL時效果明顯。
　　結(jié)論：黃連對LPS誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞損傷具有明顯保護(hù)作用，能顯著改善細(xì)胞生長狀態(tài)，減輕 LPS導(dǎo)致的細(xì)胞毒性，降低細(xì)胞凋亡率。其機(jī)制為，黃連可以影響TLR4信號通路，阻礙NF-κB和IRF3通路激活，