半滑舌鰨Gadd45g基因的克隆、功能分析和染色體熒光原位雜交.pdf

1、半滑舌鰨是一種在我國(guó)廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi),本文以山東海陽(yáng)工廠化養(yǎng)殖的半滑舌鰨為研究對(duì)象,利用多種分子生物學(xué)技術(shù)手段系統(tǒng)研究了半滑舌鰨Gadd45g基因的全長(zhǎng)cDNA克隆,分析其基因序列的進(jìn)化性,較為系統(tǒng)的研究了基因在半滑舌鰨組織和性腺發(fā)育中的表達(dá),成功將基因定位于半滑舌鰨染色體上。這些基礎(chǔ)性的研究資料將填補(bǔ)半滑舌鰨Gadd45g基因研究的空白,為揭示半滑舌鰨的性別決定機(jī)制奠定了基礎(chǔ),對(duì)半滑舌鰨性別控制有積極地作用。
　　1半滑舌鰨G

2、add45g基因的克隆和功能分析
　　本研究根據(jù)半滑舌鰨全基因組測(cè)序結(jié)果,利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù),成功的在半滑舌鰨中克隆得到了3種Gadd45g基因的全長(zhǎng)cDNA序列。Gadd45g1和Gadd45g2基因全長(zhǎng)分別是1270bp和1181bp,都有480bp的開(kāi)放閱讀框,分別編碼159個(gè)氨基酸殘基的蛋白,而Gadd45g3基因全長(zhǎng)1147bp,編碼155個(gè)氨基酸。利用生物分

3、析軟件和網(wǎng)站對(duì)基因編碼的氨基酸進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)盡管他們均有保守結(jié)構(gòu)域,但Gadd45g1基因和Gadd45g2基因相似度高,與硬骨魚(yú)中的Gadd45g型基因及高等哺乳動(dòng)物的Gadd45g基因有較近親緣關(guān)系,而Gadd45g3基因則與硬骨魚(yú)中的Gadd45g-like型基因有較相似。利用熒光實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)對(duì)半滑舌鰨各組織中的3種Gadd45g基因的表達(dá)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)Gadd45g1基因只在雌魚(yú)中表達(dá),且在肝臟表達(dá)最高,其次為性腺

4、;Gadd45g2基因在雌魚(yú)性腺表達(dá)最高,在雌魚(yú)其他組織及雄魚(yú)的所有組織均微量表達(dá);Gadd45g3基因在雌雄魚(yú)的腦中表達(dá)最高。對(duì)比雌、雄和偽雄魚(yú)的性腺中3種基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Gadd45g1和Gadd45g2基因在半滑舌鰨雌魚(yú)性腺中表達(dá)高,在雄魚(yú)和偽雄魚(yú)中表達(dá)低;Gadd45g3基因在雄魚(yú)和偽雄魚(yú)的性腺中高表達(dá),在雌魚(yú)性腺中表達(dá)低。在半滑舌鰨仔魚(yú)的性腺發(fā)育各時(shí)期,對(duì)3個(gè)基因的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),Gadd45g1基因在50d即半滑舌鰨性腺即將分

5、化的時(shí)期表達(dá)相對(duì)較高,該基因可能是半滑舌鰨性別決定的關(guān)鍵基因;Gadd45g1和Gadd45g2在95d后的雌魚(yú)性腺中均有較高表達(dá),暗示他們?cè)诼殉舶l(fā)育中有重要作用;Gadd45g3在20d雄魚(yú)性腺中表達(dá)高,隨后降低,它對(duì)半滑舌鰨雄性性別的影響可能早于性腺分化時(shí)期,且在精巢和卵巢發(fā)育早期有較高表達(dá)。
　　2半滑舌鰨Gadd45g基因的染色體熒光原位雜交
　　對(duì)上述克隆得到的3種Gadd45g基因進(jìn)行BAC文庫(kù)篩選,成功找到含有