FHL1調(diào)控FAK信號通路在主動脈夾層形成中的作用機制研究.pdf

1、研究目的:
　　主動脈中膜退化和血管平滑肌細胞功能失調(diào)是引起主動脈夾層的主要原因，細胞骨架相關(guān)蛋白four and halfLIM domain1(FHL1)蛋白在主動脈夾層中表達下調(diào)，而且下調(diào)其表達抑制了主動脈血管平滑肌的增殖。FAK(focal adhesion kinase)信號通路介導體內(nèi)多信號通路，在細胞增殖、遷移和信號導方面發(fā)揮重要作用。有研究報道，F(xiàn)HL1間接參與了FAK介導的整合素信號通路，并且在某些疾病模型中與F

2、AK通路的相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用。本課題通過檢測FHL1與FAK通路相關(guān)蛋白的表達及其調(diào)節(jié)細胞功能等方面展開研究，明確了FHL1與FAK信號通路在調(diào)節(jié)主動脈壁重構(gòu)中相關(guān)關(guān)系，探討了FHL1參與夾層發(fā)生發(fā)展的具體機制。
　　研究方法:
　　收集正常主動脈和夾層患者的主動脈組織，常規(guī)提取組織蛋白并進行蛋白定量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blotting，WB）實驗方法，檢測并比較FHL1和Paxillin蛋白兩組主動脈脈

3、組織中的表達。再利用免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）明確FAK相關(guān)蛋白在主動脈中的分布以及FHL1蛋白與Paxillion蛋白表達的相關(guān)性。
　　構(gòu)建并包裝調(diào)控FHL1蛋白表達的腺病毒轉(zhuǎn)染人主動脈血管平滑肌細胞(humanaorta vascular smooth muscle cell，HASMC)，采用實時定量PCR(Q-RT-PCR)檢測病毒對FHL1 mRNA水平的調(diào)控，并利用Western

4、 blotting測定靶向調(diào)控FHL1表達的腺病毒對FHL1蛋白的調(diào)控效果;于此同時，采用CCK-8檢測過表達FHL1蛋白與使用FAK抑制劑下調(diào)FAK表達對細胞增殖的影響。同樣，采用細胞劃痕實驗觀察過表達FHL1蛋白與使用FAK抑制劑下調(diào)FAK表達對細胞遷移的影響。
　　構(gòu)建并包裝下調(diào)FHL1蛋白表達的腺相關(guān)病毒，通過尾靜脈注射注入小鼠體內(nèi)，用以轉(zhuǎn)染小鼠主動脈，采用實時定量PCR檢測和Western blotting實驗分別在mR

5、NA水平和蛋白表達水平檢測腺相關(guān)病毒下調(diào)FHL1表達的效果。同時構(gòu)建小鼠主動脈夾層模型，通過觀察小鼠死亡率、夾層發(fā)生率和主動脈中膜的厚度，驗證FHL1對夾層發(fā)生的影響
　　結(jié)果:
　　FHL1蛋白與Paxillin蛋白在人體主動脈組織標準中均表達低與正常人，而且Paxillin蛋白與FHL1蛋白均定位于主動脈中膜層和主動脈血管平滑肌細胞質(zhì)中。
　　靶向調(diào)控FHL1的腺病毒能有效調(diào)控mRNA水平及蛋白表達，CCK8檢測上

6、調(diào)FHL1表達，能夠促進細胞增殖，而下調(diào)FAK表達可以抑制FHL1的促細胞增殖效應(yīng)。細胞劃痕實驗結(jié)果與細胞增殖結(jié)果相似，下調(diào)FAK表達可逆反FHL1蛋白的促細胞遷移效應(yīng)。
　　靶向調(diào)控干擾FHL1表達的腺相關(guān)病毒，降低了小鼠主動脈FHL1的mRNA水平和下調(diào)了FHL1的蛋白表達。FHL1下調(diào)組小鼠的死亡率和夾層發(fā)生率都顯著高于對照組，而且其中膜厚度也較對照組明顯增加。
　　結(jié)論:
　　FHL1參與主動脈血管重塑過程可能