黑種草籽NigellaA的提取分離水解及其抗腫瘤活性的研究.pdf

1、研究背景和目的：瘤果黑種草的干燥種子作為藥用部位，主產于中國新疆和云南地區(qū)，是維吾爾族的習用藥材，維吾爾族名為“斯亞旦”，在《中華本草》記載其有抗腫瘤作用。到目前為止，專家們對黑種草籽進行的系統(tǒng)分離、分析研究，發(fā)現它除了富含揮發(fā)油和脂肪酸外，還含有黃酮類化合物、三萜皂苷類化合物和生物堿類化合物等。經國內外研究表明，百里香醌和α-常春藤苷為其主要的兩大抗腫瘤活性成分，然而國內外關于Nigella A的抗腫瘤活性及其作用機制還不清楚。因此，

2、本研究旨在分離出Nigella A并對其進行抗腫瘤活性的測定及其作用機制的初步研究。
　　方法：1.利用反向硅膠，凝膠色譜等分離手段對黑子草籽的70％乙醇提取物進行了分離，從中得到了Nigella A，并對其進行水解，采用大孔樹脂，凝膠色譜等分離手段得到Nigella B，通過其理化性質，化學反應和波譜手段(NMR)進行了結構鑒定。
　　2.以人卵巢癌細胞株Sk-ov-3，人肺癌細胞株A549，人肝癌細胞株HepG2，人前列

3、腺癌細胞株PC3，人結直腸腺癌細胞株Sw620，人宮頸癌細胞株Hela，人乳腺癌細胞株MDA-MB-231為實驗瘤株，采用MTT法測定Nigella A和NigellaB孵育不同時間段后細胞活力和細胞增值活性。并用SPSS17.0計算實驗用化合物的IC50，比較Nigella A和Nigella B在不同的時間點對細胞的抑制作用?？紤]到細胞的增殖速率和裸鼠移植瘤的成瘤率，所以選用Sw620進行體內實驗。通過對裸鼠腋下接種人結直腸腺癌細胞

4、株Sw620，構建裸鼠皮下移植瘤模型，通過每天口服和腹腔給藥后隔天測定腫瘤體積和裸鼠重量，計算抑瘤率和相對增值率（T/C），并計算肝指數，脾指數;定期觀察裸鼠的體重和行為變化，評價藥物的毒性。
　　3.體內裸鼠Nigella A給藥結束后處死裸鼠，剖取腫瘤，并切取部分腫瘤組織提取蛋白，Western Blot測定7種蛋白因子Caspase-3，PARP，Akt，P-Akt，mTOR，P-mTOR及LC3Ⅱ變化;體外Nigella

5、B孵育結腸癌細胞后，提取細胞總蛋白，Western Blot檢測上述蛋白因子的變化。
　　結果：1.從黑種草籽乙醇提取物中分離得到Nigella A，然后從Nigella A的水解產物中分離得到Nigella B，通過理化性質和波譜手段(NMR)確定了兩個化合物的結構，分別為常春藤皂苷元-3-O-[β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯糖基]28-O-[α-L-鼠李糖基(1→4)β-D-葡萄糖基(

6、1→6)β-D-葡萄糖苷]，常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃木糖基(1→3)-α-L-鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯糖苷。
　　2.Nigella A在體外無抗腫瘤活性，Nigella B在體外具有明顯的抗腫瘤活性，其作用強度與濃度成正相關作用，且抑制作用會隨著作用時間的延長而加大。同時Nigella B對細胞的抑制具有細胞依賴性，抑制效果從強到弱依次為Hela，PC3，Sw620，A549，MDA-MB-231，HepG2

7、，Sk-ov-3。體內結果發(fā)現，Nigella A和Nigella B都具有抗腫瘤活性，但是Nigella B的毒副作用比Nigella A大。與模型組相比，NigellaA灌胃低，中，高劑量組和腹腔組的抑瘤率均有顯著性差異(p＜0.05)且抑制率分別為40.78％，47.38％，53.04％，42.82％，Nigella B和環(huán)磷酰胺的抑瘤率分別為37.20％(p＜0.05)，54.87％(p＜0.05);各組的相對腫瘤增值率分別為7

8、0.36％(p＜0.05)，52.45％(p＜0.05)，39.72％(p＜0.05)，74.66％(p＜0.05)，76.58％(p＜0.05)，51.61％(p＜0.05);各組的脾指數，肝指數和模型組相比均無明顯差異(p＞0.05)。
　　3.Western blot結果顯示Nigella A能使p-mTOR蛋白，pro-PARP蛋白表達量降低，同時使Caspase-3，p-Akt，cleaved-PARP，LC3Ⅱ的蛋白表

9、達量增加，Akt蛋白和mTOR蛋白表達量基本不變。Nigella B體外蛋白表達和Nigella A體內蛋白表達基本一致，并呈量效關系。
　　結論：1.通過對Nigella A體內機制的探討，發(fā)現其抗結腸癌的作用機制可能是通過直接抑制mTOR，激活自噬通路產生抗腫瘤作用。此外，Nigella A增加了Caspase-3的蛋白表達，并使PARP發(fā)生剪切，使細胞發(fā)生凋亡從而產生抗腫瘤作用。由于直接抑制mTOR，一方面反饋性激活Akt，