脆江蘺多糖的提取分離及抗腫瘤活性研究.pdf

1、腫瘤是當(dāng)今世界直接危及人類生命的一種最常見(jiàn)的疾病。傳統(tǒng)放、化療藥物不僅可殺死腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞的傷害也較大；因此，安全性高、毒性低的抗腫瘤藥物的研發(fā)已受到世界各國(guó)腫瘤研究的重視。具有免疫調(diào)節(jié)活性、抗腫瘤功效的天然大分子多糖，對(duì)腫瘤的抑制效果好，毒副作用??；用于腫瘤的輔助治療安全性高，可行性強(qiáng)。
　　脆江蘺是一種新興養(yǎng)殖海藻，目前已在廣東南澳縣人工養(yǎng)殖成功，可大面積培養(yǎng)。然而與其應(yīng)用的報(bào)道幾乎處于空白，開(kāi)展相關(guān)研究已迫在眉睫。因此

2、，本文以脆江蘺為實(shí)驗(yàn)材料，研究其多糖的提取、分離工藝條件及組成；在發(fā)現(xiàn)脆江蘺多糖具有抗氧化活性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其體內(nèi)外抗腫瘤作用及作用機(jī)制，以期為脆江蘺的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。具體內(nèi)容如下：
　　1）響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝條件
　　通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定響應(yīng)面法優(yōu)化分析的自變量因素，通過(guò)整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)自變量的優(yōu)化組合，得到脆江蘺多糖的最優(yōu)提取工藝條件為：浸提溫度93.1℃、料液比1:60.1、超聲作用時(shí)間35.8min。

3、在此條件下，脆江蘺多糖（GLP）提取得率為16.75％。
　　2）多糖的分離純化和組成分析
　　先后采用DEAE C-52和Sephadex G-100柱層析對(duì)多糖粗提物進(jìn)行分離純化。得到三個(gè)多糖級(jí)分，分別為 GLP-1、GLP-2，GLP-3，經(jīng)化學(xué)分析和紅外光譜等
　　分析表明脆江蘺多糖由 D-半乳糖和3,6-內(nèi)醚半乳糖（3,6-AG）組成，為具有α-糖苷鍵的硫酸多糖。
　　3）多糖自由基清除能力測(cè)定

4、　　測(cè)定了多糖對(duì)自由基的清除活性，結(jié)果表明：脆江蘺多糖具有較強(qiáng)的自由基清除能力，對(duì)·OH和DPPH·自由基的清除率分別高達(dá)59.15%和33.78%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活力。
　　4）體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)
　　采用MTT法考察脆江蘺多糖對(duì)體外培養(yǎng)的EC-109、MCF-7、HepG-2、HeLa細(xì)胞增殖的影響，并初步探討其腫瘤抑制機(jī)制。得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：脆江蘺多糖濃度為1000μg/mL時(shí)，對(duì)HeLa、HepG-2、MCF-7、EC

5、-109細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到49.11%，41.18%，34.98%，31.33%，并呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。觀察抑制率最高的Hela細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)合Annexin V-FITC/PI雙熒光染色，發(fā)現(xiàn)：劑量濃度范圍內(nèi)，隨著GLP給藥劑量的增加，凋亡晚期/壞死的細(xì)胞數(shù)量不斷增多，而未經(jīng)處理的陰性對(duì)照僅有少量細(xì)胞凋亡；表明GLP通過(guò)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡而抑制其增殖。
　　5）體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)
　　以S180小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?-氟尿嘧

6、啶作陽(yáng)性藥物，考察脆江蘺多糖對(duì)S180肉瘤生長(zhǎng)的抑制活性，同時(shí)通過(guò)測(cè)定荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)各項(xiàng)生化指標(biāo)，探討GLP的抗腫瘤機(jī)制。結(jié)果表明模型小鼠胸腺和脾臟指數(shù)顯著下降，免疫器官受損，而陽(yáng)性藥物在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)對(duì)免疫器官也有較大程度的損害，毒副作用較大；脆江蘺多糖對(duì)S180荷瘤小鼠具有較強(qiáng)的抑瘤活性，當(dāng)腹腔注射劑量為100mg/kg bw d-1時(shí)，對(duì)S180肉瘤的抑制率達(dá)到34.75%，高于中劑量灌胃組（200mg/kg bw d-1）

7、的腫瘤抑制率（31.35%）。同時(shí)，給予脆江蘺多糖的荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)顯著增大（P＜0.01），并激活了淋巴細(xì)胞的增殖分化，血清IL-2水平、IFN-γ水平極顯著上升（P＜0.01），IL-10水平極顯著下降（P＜0.01），對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)表現(xiàn)出較好的保護(hù)作用。對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)觀察，可見(jiàn)隨著脆江蘺多糖給藥劑量的增加，腫瘤組織壞死程度加重，腫瘤細(xì)胞核溶解，細(xì)胞融合，結(jié)構(gòu)不清。結(jié)果顯示，脆江蘺多糖具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，且毒副作