蚓激酶活性及蛋白成分的研究.pdf

1、蚓激酶（Lumbrokinase，LK）又稱蚯蚓纖溶酶，是一類來源于蚯蚓的具有纖溶活性蛋白酶的總稱。自1983年日本學(xué)者M(jìn)ihara等從粉正蚓中分離到6種具有纖溶活性的蛋白質(zhì)以來，許多學(xué)者對蚓激酶進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。文獻(xiàn)報道蚓激酶的主要成分是一組來源于蚯蚓的絲氨酸蛋白酶，包括纖維蛋白溶酶、纖維蛋白溶酶原激活物以及類似組織型纖維蛋白溶酶原激活物等。但蚓激酶在國外均沒有作為藥品上市。我國于1992年上市，臨床應(yīng)用于缺血性腦血管病中纖維蛋白原增

2、高及血小板凝集率增高的患者。全國有5家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)蚓激酶原料及腸溶制劑，其生產(chǎn)原料均來源于人工養(yǎng)殖的赤子愛勝蚓（Eisenia fetida），生產(chǎn)工藝簡單粗放。
　　蚓激酶作為我國特有的一種酶類生化藥物，在臨床上應(yīng)用廣泛，療效好。但是，由于其前期研究基礎(chǔ)不足，產(chǎn)品的有效成分、活性研究、控制方法等均比較薄弱，有必要采用現(xiàn)代分析技術(shù)對產(chǎn)品中存在的問題深入研究，從而對產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性提升提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。為此，本文采用質(zhì)譜、酶譜、親

3、和層析、離子交換層析、纖維平板量反應(yīng)平行線法等手段，對蚓激酶的成分組成、化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性、質(zhì)量控制方法等進(jìn)行了系統(tǒng)研究。本文重點(diǎn)從三個方面對蚓激酶進(jìn)行研究。
　　蚓激酶組成成分研究采用胰凝乳蛋白酶酶解、LC-MS分離測定、Protein Lynx Global Server3.0軟件分析，結(jié)果顯示我國該品種的五家生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品中主要存在15種蛋白質(zhì)，包括4種溶纖酶與10種激酶。其中纖溶酶在每個生產(chǎn)企業(yè)的樣品中均有檢出，一致性較好。

4、蚓激酶國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中檢出5種與溶纖活性相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括2種纖溶酶與3種激酶。該研究表明國產(chǎn)蚓激酶原料藥中存在蚓激酶活性蛋白成分，存在與溶纖活性相關(guān)的蛋白質(zhì)組分。
　　蚓激酶活性研究重點(diǎn)研究了總活性定量和活性成分識別。對蚓激酶直接纖溶活性及間接纖溶活性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示蚓激酶不僅具有直接降解纖維蛋白的功能，還有激活纖維蛋白溶酶原起到間接溶解纖維蛋白的功能。基于蚓激酶的生物學(xué)活性及傳統(tǒng)效價測定方法的局限，引入了生物統(tǒng)計方法——量反應(yīng)

5、平行線法測定蚓激酶效價。結(jié)果顯示蚓激酶原料藥及標(biāo)準(zhǔn)品均符合量反應(yīng)平行線法統(tǒng)計學(xué)要求，該法更適用于蚓激酶的生物學(xué)活性測定。
　　基于蚓激酶直接降解纖維蛋白的特點(diǎn)，建立測定蚓激酶活性蛋白成分的纖溶酶譜法。結(jié)果顯示纖溶酶譜法能夠清晰的顯示蚓激酶活性蛋白的存在，并且能夠作為評價蚓激酶生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性的一種有效的手段。
　　蚓激酶活性蛋白分離純化基于前期初步質(zhì)譜鑒定結(jié)果及酶學(xué)活性，嘗試找到蚓激酶單一活性蛋白。將蚓激酶通過DEAE陰離子交