線粒體編碼區(qū)COⅠ、COⅡ、COⅢ基因單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病風險的相關性研究.pdf

1、目的：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)，顯示乳腺癌在全世界女性中的發(fā)病率排名第一，死亡率列惡性腫瘤第五位;中國腫瘤登記點公布的數(shù)據(jù)顯示乳腺癌是中國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，死亡率位居第六。乳腺癌是一種多基因、多因素和多階段累計的過程，呈現(xiàn)明顯的家族聚集性，其中基因改變被認為是乳腺癌發(fā)生的基礎。不同于核DNA（nuclear DNA），線粒體DNA（mitochondrial DNA）缺乏組蛋白的保護、修復能力

2、差以及處于富含活性氧（簡稱 ROS）的環(huán)境中，因此易于產(chǎn)生氧化應激損傷，從而易于發(fā)生基因改變。針對線粒體基因與乳腺癌發(fā)病風險的相關性，眾多學者展開了大量的研究工作，研究結(jié)果表明表明線粒體 D-loop區(qū)基因多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病風險具有相關性。線粒體基因 D-loop區(qū)通過影響線粒體基因的轉(zhuǎn)錄及復制而改變線粒體基因，而線粒體基因編碼區(qū)因其幾乎不含有內(nèi)含子，故線粒體編碼區(qū)基因的單核苷酸多態(tài)性可通過改變編碼的氨基酸類型從而改變線粒體功能。因此

3、，開展線粒體編碼區(qū)基因與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的相關性研究具有重要的意義。本研究中選擇線粒體編碼區(qū)基因為研究對象，主要檢測區(qū)域為線粒體編碼區(qū)基因 COX，選取外周靜脈血液樣本，進行測序并與標準序列進行對比找到多態(tài)性位點，運用 KW與卡方檢驗探究多態(tài)性位點、多態(tài)性頻次與乳腺癌發(fā)病風險的相關性，為解決乳腺癌發(fā)病風險評估方法提供了一種新的思路。
　　方法：
　　1.線粒體DNA的提取，所有患者均為女性，既往無乳腺及其他惡性腫瘤病史，且均

4、為非孕期。所有入組患者均于2008年1月至2015年10月期間在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院乳腺中心就診。其中本次實驗入組的散發(fā)性乳腺癌患者為161名，家族性乳腺癌患者為67名，所有患者均經(jīng)病理證實為乳腺癌。家族性乳腺癌的一級親屬共41名，此外還有161名正常對照組，均為在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院體檢中心體檢的無乳腺疾病的健康人，乳腺疾病包括良性和惡性乳腺疾病。
　　2.目的基因檢測，PCR擴增產(chǎn)物測序，在網(wǎng)站獲取劍橋標準人類線粒體DNA序列

5、,然后利用兩款軟件進行DNA序列分析。首先應用DNAMAN序列分析軟件，將各實驗組的血線粒體DNA目的基因段與以獲取的標準序列進行多序列對比分析，找出提示的突變位點。然后在 Chromas軟件中找到相對應的突變位點，再次確認是否發(fā)生突變，并記錄下來。
　　3.統(tǒng)計、分析，把經(jīng)過對比分析的資料，進行仔細、嚴密的匯總。內(nèi)容主要包括有多少突變位點，以及每一個突變位點在各實驗分組中的人員配比情況，列出相應的表格。采用卡方檢驗（χ2檢驗，P

6、earsonChi-Squaretest)對各組資料的構成比進行分析。要求理論頻數(shù)不應小于5。當有1=<理論頻數(shù)<5時，運用連續(xù)性校正卡方檢驗，當理論頻數(shù)小于1時，運用確切概率法計算概率。多態(tài)性位點分布頻次的分析采用Kruskal-WallisH檢驗，對樣本總體進行檢驗，如果 P<0.05，樣本總體具有統(tǒng)計學差異，再使用nemenyi繼續(xù)4組間分析，P<0.0126，具有統(tǒng)計學差異。所有的數(shù)據(jù)應用SPSSversion21統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)

7、計分析，P<0.05被認為是有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.臨床資料分析，各組間年齡的比較未見明顯差異，提示各組間年齡均衡，其他實驗數(shù)據(jù)具有可比性。對于家族和散發(fā)性乳腺癌組患者的臨床資料進行對比，兩組的病理類型（P=0.013）有統(tǒng)計學差異，其中髓樣癌（P=0.012）、浸潤性小葉癌（P=0.045），家族性乳腺癌患者以上類型腫瘤發(fā)生率較散發(fā)性乳腺癌高，提示家族性乳腺癌患者病理類型惡性程度更高。其余的臨床資料，分別包括臨

8、床分期（P=0.436）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.069）、絕經(jīng)情況（P=0.152）、HER-2的表達（P=0.218）及激素受體的表達情況（P=0.847），均無明顯統(tǒng)計學差異，提示本組研究中的散發(fā)性和家族性患者的臨床生物學特性相匹配。
　　2.線粒體基因編碼區(qū) COⅠ、COⅡ、COⅢ基因多態(tài)性改變與乳腺癌發(fā)病風險的相關性分析。
　　各實驗組的多態(tài)性改變經(jīng)過統(tǒng)計學分析，運用卡方檢驗（χ2檢驗， PearsonChi-Squa

9、retest)計算出P值，P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義，可以考慮這個位點的多態(tài)性改變與乳腺癌的發(fā)病風險相關。
　　2.1散發(fā)乳腺癌組與正常對照組統(tǒng)計學分析，在線粒體基因編碼區(qū)COⅠ基因上，散發(fā)性乳腺癌組與正常對照組相比7196C/A位點（P=0.034）存在多態(tài)性，具有統(tǒng)計學差異。在線粒體基因編碼區(qū)COⅢ基因上，散發(fā)性乳腺癌組與正常對照組比較，9545A/G（P=0.036）、9548G/A（P=0.003）位點存在多態(tài)性，具有

10、統(tǒng)計學意義，提示這些位點多態(tài)性可能與乳腺癌的發(fā)病風險具有相關性。
　　2.2在9548G/A位點，家族性乳腺癌組與對照組比較，此位點多態(tài)性發(fā)生率高，具有統(tǒng)計學差異，但與散發(fā)性乳腺癌組對比，發(fā)生率無明顯差別，無明顯統(tǒng)計學差異，提示此位點的多態(tài)性可能僅與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有相關性。
　　3.各實驗組的線粒體基因 COⅠ（5904~7445base）、COⅡ（7586~8269base）、COⅢ（9207~9990base）每個樣

11、本多態(tài)性位點頻次分布與乳腺癌發(fā)病風險。
　　分為兩組進行比較，均采用 Kruskal-WallisH檢驗，對樣本總體進行檢驗（P<0.05視為具有統(tǒng)計學差異），Nemenyi（4組間比較α=0.125）數(shù)據(jù)結(jié)果提示散發(fā)性乳腺癌組、家族性乳腺癌組、一級親屬組多態(tài)性頻次分布在引物4和6號組較正常對照組均有統(tǒng)計學差異，均高于健康對照組。但散發(fā)性乳腺癌與家族性乳腺癌之間、散發(fā)性乳腺癌和一級親屬及家族性乳腺癌和一級親屬組多態(tài)性頻次無明顯統(tǒng)計

12、學差異。提示線粒體基因氧化損傷在散發(fā)性乳腺癌及家族性乳腺癌親屬中的累積高于正常對照組。
　　結(jié)論:
　　1.COⅠ、COⅡ、COⅢ基因的檢測中，發(fā)現(xiàn)7196C/A位點、9545A/G、9548G/A與散發(fā)性乳腺癌的發(fā)病風險具有相關性，增加了散發(fā)性乳腺癌的發(fā)病風險。
　　2.9548G/A位點可能同時增加了家族性和散發(fā)性乳腺癌的發(fā)病風險。
　　3.在線粒體編碼區(qū)COX基因的7100-7700bp及9300-1000