線粒體編碼區(qū)COⅠ、COⅡ、COⅢ基因單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)，顯示乳腺癌在全世界女性中的發(fā)病率排名第一，死亡率列惡性腫瘤第五位;中國(guó)腫瘤登記點(diǎn)公布的數(shù)據(jù)顯示乳腺癌是中國(guó)女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，死亡率位居第六。乳腺癌是一種多基因、多因素和多階段累計(jì)的過(guò)程，呈現(xiàn)明顯的家族聚集性，其中基因改變被認(rèn)為是乳腺癌發(fā)生的基礎(chǔ)。不同于核DNA（nuclear DNA），線粒體DNA（mitochondrial DNA）缺乏組蛋白的保護(hù)、修復(fù)能力

2、差以及處于富含活性氧（簡(jiǎn)稱 ROS）的環(huán)境中，因此易于產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，從而易于發(fā)生基因改變。針對(duì)線粒體基因與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，眾多學(xué)者展開(kāi)了大量的研究工作，研究結(jié)果表明表明線粒體 D-loop區(qū)基因多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性。線粒體基因 D-loop區(qū)通過(guò)影響線粒體基因的轉(zhuǎn)錄及復(fù)制而改變線粒體基因，而線粒體基因編碼區(qū)因其幾乎不含有內(nèi)含子，故線粒體編碼區(qū)基因的單核苷酸多態(tài)性可通過(guò)改變編碼的氨基酸類型從而改變線粒體功能。因此

3、，開(kāi)展線粒體編碼區(qū)基因與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究具有重要的意義。本研究中選擇線粒體編碼區(qū)基因?yàn)檠芯繉?duì)象，主要檢測(cè)區(qū)域?yàn)榫€粒體編碼區(qū)基因 COX，選取外周靜脈血液樣本，進(jìn)行測(cè)序并與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對(duì)比找到多態(tài)性位點(diǎn)，運(yùn)用 KW與卡方檢驗(yàn)探究多態(tài)性位點(diǎn)、多態(tài)性頻次與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，為解決乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法提供了一種新的思路。
　　方法：
　　1.線粒體DNA的提取，所有患者均為女性，既往無(wú)乳腺及其他惡性腫瘤病史，且均

4、為非孕期。所有入組患者均于2008年1月至2015年10月期間在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心就診。其中本次實(shí)驗(yàn)入組的散發(fā)性乳腺癌患者為161名，家族性乳腺癌患者為67名，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為乳腺癌。家族性乳腺癌的一級(jí)親屬共41名，此外還有161名正常對(duì)照組，均為在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院體檢中心體檢的無(wú)乳腺疾病的健康人，乳腺疾病包括良性和惡性乳腺疾病。
　　2.目的基因檢測(cè)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，在網(wǎng)站獲取劍橋標(biāo)準(zhǔn)人類線粒體DNA序列

5、,然后利用兩款軟件進(jìn)行DNA序列分析。首先應(yīng)用DNAMAN序列分析軟件，將各實(shí)驗(yàn)組的血線粒體DNA目的基因段與以獲取的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行多序列對(duì)比分析，找出提示的突變位點(diǎn)。然后在 Chromas軟件中找到相對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)，再次確認(rèn)是否發(fā)生突變，并記錄下來(lái)。
　　3.統(tǒng)計(jì)、分析，把經(jīng)過(guò)對(duì)比分析的資料，進(jìn)行仔細(xì)、嚴(yán)密的匯總。內(nèi)容主要包括有多少突變位點(diǎn)，以及每一個(gè)突變位點(diǎn)在各實(shí)驗(yàn)分組中的人員配比情況，列出相應(yīng)的表格。采用卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)，P

6、earsonChi-Squaretest)對(duì)各組資料的構(gòu)成比進(jìn)行分析。要求理論頻數(shù)不應(yīng)小于5。當(dāng)有1=<理論頻數(shù)<5時(shí)，運(yùn)用連續(xù)性校正卡方檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)小于1時(shí)，運(yùn)用確切概率法計(jì)算概率。多態(tài)性位點(diǎn)分布頻次的分析采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，對(duì)樣本總體進(jìn)行檢驗(yàn)，如果 P<0.05，樣本總體具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，再使用nemenyi繼續(xù)4組間分析，P<0.0126，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSSversion21統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)

7、計(jì)分析，P<0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.臨床資料分析，各組間年齡的比較未見(jiàn)明顯差異，提示各組間年齡均衡，其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有可比性。對(duì)于家族和散發(fā)性乳腺癌組患者的臨床資料進(jìn)行對(duì)比，兩組的病理類型（P=0.013）有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中髓樣癌（P=0.012）、浸潤(rùn)性小葉癌（P=0.045），家族性乳腺癌患者以上類型腫瘤發(fā)生率較散發(fā)性乳腺癌高，提示家族性乳腺癌患者病理類型惡性程度更高。其余的臨床資料，分別包括臨

8、床分期（P=0.436）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.069）、絕經(jīng)情況（P=0.152）、HER-2的表達(dá)（P=0.218）及激素受體的表達(dá)情況（P=0.847），均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示本組研究中的散發(fā)性和家族性患者的臨床生物學(xué)特性相匹配。
　　2.線粒體基因編碼區(qū) COⅠ、COⅡ、COⅢ基因多態(tài)性改變與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析。
　　各實(shí)驗(yàn)組的多態(tài)性改變經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)， PearsonChi-Squa

9、retest)計(jì)算出P值，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以考慮這個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性改變與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。
　　2.1散發(fā)乳腺癌組與正常對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在線粒體基因編碼區(qū)COⅠ基因上，散發(fā)性乳腺癌組與正常對(duì)照組相比7196C/A位點(diǎn)（P=0.034）存在多態(tài)性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在線粒體基因編碼區(qū)COⅢ基因上，散發(fā)性乳腺癌組與正常對(duì)照組比較，9545A/G（P=0.036）、9548G/A（P=0.003）位點(diǎn)存在多態(tài)性，具有

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這些位點(diǎn)多態(tài)性可能與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性。
　　2.2在9548G/A位點(diǎn)，家族性乳腺癌組與對(duì)照組比較，此位點(diǎn)多態(tài)性發(fā)生率高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與散發(fā)性乳腺癌組對(duì)比，發(fā)生率無(wú)明顯差別，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示此位點(diǎn)的多態(tài)性可能僅與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有相關(guān)性。
　　3.各實(shí)驗(yàn)組的線粒體基因 COⅠ（5904~7445base）、COⅡ（7586~8269base）、COⅢ（9207~9990base）每個(gè)樣

11、本多態(tài)性位點(diǎn)頻次分布與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　分為兩組進(jìn)行比較，均采用 Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，對(duì)樣本總體進(jìn)行檢驗(yàn)（P<0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），Nemenyi（4組間比較α=0.125）數(shù)據(jù)結(jié)果提示散發(fā)性乳腺癌組、家族性乳腺癌組、一級(jí)親屬組多態(tài)性頻次分布在引物4和6號(hào)組較正常對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均高于健康對(duì)照組。但散發(fā)性乳腺癌與家族性乳腺癌之間、散發(fā)性乳腺癌和一級(jí)親屬及家族性乳腺癌和一級(jí)親屬組多態(tài)性頻次無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)差異。提示線粒體基因氧化損傷在散發(fā)性乳腺癌及家族性乳腺癌親屬中的累積高于正常對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　1.COⅠ、COⅡ、COⅢ基因的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)7196C/A位點(diǎn)、9545A/G、9548G/A與散發(fā)性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性，增加了散發(fā)性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　2.9548G/A位點(diǎn)可能同時(shí)增加了家族性和散發(fā)性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
　　3.在線粒體編碼區(qū)COX基因的7100-7700bp及9300-1000