ABCG1基因單核苷酸多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究.pdf

1、[研究背景]
　　 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(Coronary AtherosclerotiC Disease,CAD)，簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病，是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的世界性疾病。在其發(fā)生過(guò)程中，環(huán)境因素如吸煙等起著重要的作用，同時(shí)遺傳因素在其中的作用也已經(jīng)得到公認(rèn)。脂質(zhì)代謝素亂是動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素。血液中高水平的LDL膽固醇總是與CAD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的升高密切相關(guān)，而高水平的HDL膽固醇可以降低CAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。家系研究表明，LDL、

2、HDL和TG等血脂水平受到個(gè)體遺傳背景的影響。最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)可顯著影響血脂水平的基因座，而且這些基因座上的遺傳多態(tài)同樣與CAD的發(fā)病密切相關(guān)。
　　 ABCAI與ABCGI是ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)子超家族中的兩個(gè)成員，它們通過(guò)相互獨(dú)立的機(jī)制參與調(diào)節(jié)膽固醇代謝平衡，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇和磷脂向HDL轉(zhuǎn)運(yùn)，避免外周細(xì)胞膽固醇嚴(yán)重沉積。ABCA1基因常見(jiàn)多態(tài)性與血漿脂質(zhì)水平和CAD易感性有著一定的關(guān)聯(lián)，ABCAI基因的缺失

3、更可導(dǎo)致易患動(dòng)脈粥樣硬化的丹吉爾病。但ABCGI在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用仍然沒(méi)有完全明確。通過(guò)移植Abcgl-/-小鼠的骨髓，動(dòng)脈粥樣硬化模型鼠僅僅出現(xiàn)了輕度的病變減輕甚至發(fā)生病變面積的增加。鑒于體內(nèi)總ABCGI的表達(dá)可以阻止動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)一步發(fā)展的事實(shí)，人們通常還是認(rèn)為ABCGI對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有保護(hù)作用。
　　 [研究目的]
　　 應(yīng)用基于群體的病例-對(duì)照關(guān)聯(lián)研究，探討ABCG1基因與山東漢族人群CAD發(fā)病

4、和病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，并初步驗(yàn)證ASCG1基因啟動(dòng)子區(qū)域單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism,SNP）對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　 [研究方法]
　　 基于群體的病例，對(duì)照關(guān)聯(lián)研究：
　　 1.收集CAD患者541例和正常對(duì)照649例血樣，提取基因組DNA，對(duì)研究對(duì)象臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。根據(jù)CAD患者冠脈挾窄程度，將病例組分為GcrLsim積分大于45和小于等于45的兩組

5、，進(jìn)行病例組內(nèi)的分析。
　　 2.選取ABCG1基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的三個(gè)SNPrs4148082、rs1893590、n1378577，位于第7內(nèi)含子的tag SNPrs225374，位于3’非翻譯區(qū)(3'UTR)的tagSNP rs1044317，通過(guò)PCR-RFLP法進(jìn)行基因分型。
　　 3.分別計(jì)算各SNP位點(diǎn)基因型與等位基因在病例組與對(duì)照組中的頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢測(cè)，以確定選取的S

6、NP位點(diǎn)在病例組與對(duì)照組中均處于遺傳平衡狀態(tài)，具有群體代表性。分析各SNP位點(diǎn)間連鎖不平衡狀況，計(jì)算D’和r2值。
　　 4.采用logistic回歸模型法分析各SNP位點(diǎn)與疾病表型的相關(guān)性，分別在廣義模型、乘法模型、顯性模型、隱性模型和加法模型假定下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷，通過(guò)比較各遺傳模型推斷結(jié)果，確定遺傳模型，得出合理的結(jié)論。
　　 ABCG1基因啟動(dòng)子區(qū)域SNP對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性影響的初步驗(yàn)證：
　　 1.根據(jù)基因庫(kù)中

7、的基因組序列信息，采用Mat Inspector軟件對(duì)ABCG1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約lkb序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析。
　　 2.在前面基因分型結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)，構(gòu)建四種包含不同ABCGI基因啟動(dòng)子單體型的表達(dá)載體，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞，再用22(R)羥基膽甾醇(22(R)-hydroxycholesterol）和9-順-視磺酸(9-cis-retinoic acid)進(jìn)行誘導(dǎo)，檢

8、測(cè)熒光素酶表達(dá)活性。
　　 [結(jié)果]
　　 1.ABCGI基因各SNP位點(diǎn)在病例組與對(duì)照組中均處于遺傳平衡狀態(tài)，具有群體代表性。啟動(dòng)子區(qū)域的三個(gè)SNP rs4148082，rs1893590，rs1378577間處于相對(duì)較強(qiáng)的連鎖不平衡狀態(tài)，tagSNPrs225374，rs1044317與其它SNP位點(diǎn)間處于非常弱的連鎖不平衡狀態(tài)。
　　 2.啟動(dòng)子區(qū)域的三個(gè)SNPrs4148082，n1893590，rs13

9、78577各基因型及等位基因頻率分布在CAD組與對(duì)照組中沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。而rs225374等位基因C在病例組中的頻率高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0R=1.186，95％CI:1.009-1.394，P=0.039)。rs1044317等位基因A在病例組中的頻率高于對(duì)照組，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.187，95％CI:1.009-1.397，P=0.039)。tag SNPrs225374，rs1044317在加法模型下

10、同樣與CAD發(fā)病具有相關(guān)性。
　　 3.在女性病例組內(nèi)分析中，啟動(dòng)子區(qū)域的三個(gè)SNPrs4.148082，rs1893590，rs1378577罕見(jiàn)等位基因在女性高Gensini積分組中的頻率高于女性低Gcnsini積分組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在加法模型下與女性CAD嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。而此三個(gè)SNP位點(diǎn)在男性病例組內(nèi)及全部病例組內(nèi)分析中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。tag SNPrs225374，rs1044317在病例組內(nèi)分析中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

11、
　　 4.成功構(gòu)建四種包含不同ABCG1基因啟動(dòng)子單體型的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體。在轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞后，熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示rs4148082，rs1893590，rs1378577所組成的單體型GAT活性顯著高于單體型GCG，而單體型GAG與單體型GCG活性無(wú)明顯差異。
　　 [結(jié)論]
　　 1.ABCGI基因tag SNP rs225374，rs1044317在山東漢族人群中與CA