重組人INFα2b-igG4 Fe融合蛋白在桿狀病毒昆蟲系統(tǒng)中的表達.pdf

1、背景和目的
　　 慢性乙型病毒性肝炎是一種嚴重危害人類健康的常見病，全球目前約有3.5億慢性乙型肝炎病毒感染者；慢性丙型病毒性肝炎亦影響著全球近1.8億人，該病的危險性主要在于其高慢性化率和可能發(fā)生的嚴重并發(fā)癥，包括肝硬化和肝癌。病毒性肝炎的防治是一個全球性公共衛(wèi)生問題，已引起世界各國的關(guān)注。
　　 干擾素(interferon，IFN)是目前公認的有效抗病毒藥物，迄今在臨床上已經(jīng)使用了20多年。然而，作為一個小分子蛋白

2、，干擾素從血漿中清除的速度較快，其清除相半衰期為注射后的3～8h，24h后在血漿中就已檢測不到其存在，導致在臨床治療中需要重復多次給藥才能達到治療效果，造成臨床應用中的一些不利[1]。因此延長IFNα的半衰期，降低其副作用對IFNα的臨床應用具有重要意義。目前延長干擾素半衰期的方法主要有聚乙二醇(PEG)修飾法、融合蛋白法。近年來，人們關(guān)注抗體IgGFc段與干擾素融合蛋白(IFN/Fc)的生物學活性和藥理作用。這兩種干擾素融合蛋白的研制

3、受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，作為一種新的基因工程藥物在表達系統(tǒng)建立和蛋白質(zhì)純化等方面進行了前沿性研究。
　　 本課題基于近幾年蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)的研究進展，通過分子克隆技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，依據(jù)IgG Fc及IFN的特點，利用Bac-to-Bac桿狀病毒昆蟲表達系統(tǒng)，表達長效IFN/Fc融合蛋白，探索其基本生物學活性，期望提高干擾素的抗病毒治療效果，為長效干擾素的抗病毒治療探索新方法。
　　 方法
　　 1.利用分子克

4、隆技術(shù)獲得人IFNα2b及IgG4 Fc基因片段，構(gòu)建桿狀病毒穿梭載體pFastBacl-IFN/Fc
　　 2.轉(zhuǎn)化DH10 Bac感受態(tài)菌株，獲得重組桿粒Bacmid-IFN/Fc
　　 3.運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組桿粒Bacmid-IFN/Fc轉(zhuǎn)染至昆蟲細胞High five，
　　 4.采用Western-Blot和ELISA檢測目的蛋白的表達
　　 5.運用細胞病變抑制法測定融合蛋白體外抗病毒

5、活性
　　 結(jié)果
　　 1.經(jīng)PCR擴增、限制性內(nèi)切酶酶切及核苷酸序列測定，證實獲得IFNα2b及IgG4Fc基因片段，且正確克隆至桿狀病毒穿梭載體pFastBacl中
　　 2.在DH10 Bac菌株中篩選出含目的基因的重組桿粒
　　 3.重組桿粒轉(zhuǎn)染High Five細胞后出現(xiàn)病理變化，表明轉(zhuǎn)染成功并獲得重組桿狀病毒
　　 4.ELISA證實兔抗人IFNα抗體能夠識別重組IFN/Fc融合蛋白<