PTSD大鼠前額皮質(zhì)神經(jīng)元PERK信號通路應答內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的分子機制.pdf

1、目的：
　　我們課題組發(fā)現(xiàn)PTSD模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡，發(fā)生細胞凋亡的途徑有三種:死亡受體徑路;線粒體徑路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路細胞凋亡是備受矚目的細胞凋亡通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是細胞內(nèi)重要的細胞器，它不僅能夠合成蛋白還是鈣的儲存場所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對于維持細胞的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要的作用。但是諸多生理或病理因素可導致未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白產(chǎn)生并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplas

2、mic reticulum stress，ERS)，啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，UPR是通過增加分子伴侶的表達來促進蛋白的正確折疊，減少錯誤折疊或未折疊蛋白的產(chǎn)生，來減少ERS對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)造成的傷害。應答UPR的機制是通過三條信號通路完成的:蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like，PERK)，肌醇需酶1(Inositol Requiring enzyme1，I

3、RE1)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(Activating Transcription factor6，ATF6)。PERK，ATF6和IRE1三個UPR信號分子可激活其下游的信號分子，達到抑制蛋白質(zhì)的合成的作用，來恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。研究表明，PERK信號通路在細胞保護與細胞凋亡過程中起到很重要的作用。
　　葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose regulated protein78，GRP78）是1977年被發(fā)現(xiàn)的分子伴侶，它是一種多功能的內(nèi)質(zhì)

4、網(wǎng)蛋白。它有兩個主要的結(jié)構(gòu)域:①N末端結(jié)構(gòu)域含有ATPase催化位點，能結(jié)合ATP;②C末端是高度保守的EEVD氨基酸序列。GRP78主要定位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[5]。在未激活的細胞中，GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白結(jié)合，使跨膜蛋白處于未激活狀態(tài)。GRP78還能夠促進正確折疊蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。GRP78不僅參與細胞的正常生命活動，也參與細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。
　　ERP57稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白57（Endoplasmic Reticulum protein

5、57），它不僅是一種二硫鍵異構(gòu)酶，也是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，可促進細胞蛋白質(zhì)二硫鍵的形成。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣網(wǎng)蛋白CRT和鈣聯(lián)蛋白CNX結(jié)合對新合成蛋白質(zhì)進行重折疊。
　　GSK2606414是特異性PERK抑制劑，分子量是451.44。在朊病毒感染的小鼠模型中，GSK2606414成功的抑制PERK信號通路并使感染鼠整體水平得到恢復，使小鼠得到救治。GSK2606414有精準的激酶選擇性和藥動力學特征為臨床前階段的研究奠定了基礎。在我們

6、的實驗中，我們采用GSK2606414阻斷PERK信號通路，進一步觀察PERK的作用。PERK信號通路與學習記憶功能有關，PERK激活后引起p-eIF2a的表達增多，p-eIF2a能夠抑制學習記憶蛋白的產(chǎn)生，從而抑制了大鼠的學習記憶，因此，我們就猜想PERK信號通路是否也參與到了PTSD的發(fā)病呢。另外，激活后的PERK作用于其下游的靶分子，上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，應答ERS。有報道程，與ATF6和IRE1信號通路相比，PERK信號通路對ER

7、S更為敏感，在抵抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中發(fā)揮著重要的作業(yè)，因此，PERK對應激細胞的存活與凋亡的起著決定性的作用。
　　研究表明PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激并出現(xiàn)細胞凋亡的改變，這可能是導致其結(jié)構(gòu)改變、體積縮小，引起功能下降的原因，這也與PTSD的發(fā)病有一定關系。鑒于PERK信號通路及分子伴侶GRP78，ERP57及CRT在UPR及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路細胞凋亡上的重要作用，同時PERK信號通路參與大腦的學習記憶，并且目前沒有關于mPFC神

8、經(jīng)元PERK信號通路與PTSD發(fā)病關系的研究，因此，我們將其作為了研究切入點，來深入探討PTSD大鼠mPFC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK通路應答內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的分子機制，來揭示PTSD的部分發(fā)病機制，也為有效治療PTSD提供新思路。
　　方法：
　　1.采用單一連續(xù)刺激(Single-Prolonged Stress，PTSD-SPS)來構(gòu)建PTSD動物模型。
　　2.采用行為學方法檢測大鼠的行為學變化，行為學方法包括Morri

9、s水迷宮測試(Morris Water Maze Test，MWM)，高架十字迷宮(Plus Maze Test)和曠場實驗(Open Field Maze Test)，來驗證PTSD-SPS動物模型是否成功。新物體識別實驗(The Novel object recognization test，NOR)來檢測大鼠的前額皮質(zhì)相關的學習記憶能力。
　　3.熒光分光光度計檢測mPFC神經(jīng)元細胞內(nèi)游離Ca2+濃度:取正常對照組及SPS7

10、d大鼠，經(jīng)麻醉，開顱取mPFC100mg，制備106～107/ml的細胞懸液后，在細胞懸液中加入1 mmol/L Fura-2/AM然后把細胞懸液放置于避光處孵育40min(37℃);孵育完成后利用熒光分光光度計進行檢測。
　　4.采用分子生物學技術(shù)(免疫熒光雙標、Western blotting及PCR)檢測正常組，SPS組及GSK2606414給藥組大鼠mPFC PERK信號通路蛋白及相關凋亡因子在蛋白水平和mRNA水平的表達

11、變化;
　　5.采用透射電子顯微鏡技術(shù)觀察PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及凋亡細胞的形態(tài);
　　6.采用原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡;
　　結(jié)果：
　　1.PTSD大鼠行為學改變
　　Morries水迷宮定位巡航實驗結(jié)果顯示，在前5天的定位巡航實驗中SPS大鼠找到水下平臺所需要游泳的距離明顯多于正常組，在第6天的測試實驗中，SPS大鼠在目標象限所花費的時間比明顯低于正

12、常大鼠;
　　高架十字迷宮實驗結(jié)果顯示，SPS刺激后的大鼠在開放臂的時間比明顯低于正常組;
　　曠場實驗結(jié)果顯示，SPS刺激后大鼠進入中心區(qū)域的次數(shù)明顯少于正常組。
　　2.PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元游離鈣水平及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶CRT，GRP78及ERP57的表達變化
　　實驗結(jié)果顯示，SPS刺激使mPFC神經(jīng)元內(nèi)游離鈣水平明顯增加。同時，SPS刺激增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶CRT，GRP78及ERP57的蛋白和mRNA

13、水平的表達。
　　3.PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元中PERK信號通路及相關凋亡因子變化
　　SPS組大鼠mPFC神經(jīng)元中，PERK，p-PERK，eIF2a，p-eIF2a，ATF4及CHOP的蛋白水平和mRNA水平明顯高于正常對照組。SPS大鼠mPFC神經(jīng)元中相關凋亡因子Caspase7/12/3及Bax的蛋白水平表達明顯高于正常組。
　　4.PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元ER形態(tài)及Tunel實驗結(jié)果。
　　與正常組

14、大鼠相比，SPS大鼠mPFC神經(jīng)元ER擴張，形態(tài)發(fā)生變化。
　　Tunel實驗結(jié)果顯示，與正常組大鼠相比，SPS刺激組大鼠mPFC中凋亡細胞數(shù)明顯增加。
　　5.GSK2606414藥物對SPS大鼠的影響
　　1).給藥后，各組大鼠mPFC神經(jīng)元PERK信號通路相關蛋白檢測結(jié)果
　　SPS-GSK2606414組大鼠mPFC神經(jīng)元中p-PERK，p-eIF2a，ATF4及CHOP的蛋白表達明顯低于SPS-vehi

15、cle組大鼠。
　　2).內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡因子Caspase12及Bax的檢測結(jié)果
　　SPS-GSK2606414組大鼠mPFC神經(jīng)元中caspase12及Bax的表達明顯低于SPS-vehicle組大鼠。
　　3).Tunel凋亡檢測結(jié)果
　　與SPS-vehicle組大鼠相比，SPS-GSK2606414組大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡細胞數(shù)明顯降低。
　　4).行為學檢測結(jié)果
　　Morris水迷宮實驗顯示

16、，SPS-GSK2606414組大鼠花比SPS-vehicle組大鼠更少的路程找到水下平臺，并且SPS-GSK2606414組大鼠潛伏期較SPS組大鼠短。在新物體識別實驗中，與SPS-vehicle組大鼠相比，SPS-GSK2606414組大鼠對新對象花費的時間比（新事物/舊事物）更高。
　　結(jié)論：
　　1.分子伴侶calreticulin、GRP78及ERP57介導的UPR反應參與了PTSD的發(fā)病。
　　2.PTSD