IRE1α-XBP1及ERp29在PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路凋亡中的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　創(chuàng)傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)是指經(jīng)受了突發(fā)性的巨大災難或異乎尋常威脅后產(chǎn)生的長期持續(xù)性的精神障礙或焦慮綜合癥。PTSD發(fā)病機制的研究已涉及內(nèi)分泌學、行為學、心理學及神經(jīng)生物學等多種學科領域，但目前尚未明確。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，細胞通過啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)特異性的信號系統(tǒng)來抑制蛋白翻譯，并促進未折

2、疊蛋白加工成熟和促進錯誤折疊蛋白降解，從而減輕ER蛋白負荷并促進細胞重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。然而，如果ERS嚴重且持續(xù)時間長，UPR不足以重建ER穩(wěn)態(tài)，則可能通過啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路凋亡機制引起細胞凋亡[5]。在哺乳動物中，至少存在三種能夠感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白聚集的ER跨膜蛋白—激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor6，ATF6)，蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase，PERK)和需肌醇蛋

3、白1(inositol requiringenzyme1，IRE1)。這三個UPR信號分子可通過其胞漿結(jié)構(gòu)域分別進行下游信號轉(zhuǎn)導，從而在起始階段抑制蛋白質(zhì)的合成，并誘導ERS相關蛋白的表達以恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。
　　IRE1是Ⅰ型跨膜糖蛋白，其在哺乳動物體內(nèi)有兩種存在形式—IRE1α和IRE1β。IRE1α廣泛表達于不同組織中，而IRE1β只在腸道上皮細胞中有表達。IRE1α感知未折疊蛋白的蓄積后隨即與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78/BIP

4、(glucose-regulated protein78/binding immunoglobulin protein)解離而激活[9-11]?；罨腎RE1α能特異性的剪接X-盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein1 unspliced,XBP1 u) mRNA分子內(nèi)26bp的內(nèi)含子，剪接后的mRNA編碼產(chǎn)生有活性XBP-1s(XBP1 spliced)[12-14]。XBP-1 s不僅能促進含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應元件(e

5、ndoplasmicreticulum stress responsive element，ERSE)的UPR靶分子如GRP78/BIP、GRP94表達以增加蛋白質(zhì)的折疊能力，而且可以誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解增強因子α甘露糖苷酶樣蛋白(ER degradation-enhancingα-mannosidase-like protein，EDEM)的表達以增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錯誤折疊蛋白質(zhì)的降解[15]，從而恢復細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。但IRE1-XBP1通路的作用

6、并不只是可以啟動ERS的生存途徑，當嚴重或長時程的ERS使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損時，IRE1-XBP1通路還能夠通過激活下游的凋亡信號分子，如JNK(c-JunN-terminal kinase)、CHOP/GADD153(C/EBP homologous protein/growth arrest andDNA damage-inducible gene153)、caspase-12等來誘導細胞凋亡。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29(endopla

7、smic reticulum protein29，ERp29)是在人類肝臟蛋白二維電泳時發(fā)現(xiàn)的由261個氨基酸構(gòu)成的可溶性蛋白。ERp29作為管家蛋白廣泛表達于哺乳動物組織中。目前認為ERp29作為分子伴侶參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊和分泌蛋白的輸出，但其與傳統(tǒng)的分子伴侶存在許多差異，其生物學功能目前尚未完全明確。ERp29可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志蛋白—GRP78/BIP及GRP94形成復合物相互作用[16,17]。已有研究表明XBP-1可調(diào)控內(nèi)

8、源性ERp29[18,19]，且ERp29可通過下調(diào)真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translational initiation factor2α，eIF2a)而使Hsp27表達上調(diào)以抑制doxorubicin誘導的細胞凋亡[20]。同時ERp29可使p58IPK的表達上調(diào)，從而減少eIF2a的磷酸化，并抑制ATF4/CHOP/caspase-3促凋亡通路來促進細胞存活[21]。
　　目前研究顯示，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病

9、的發(fā)病機制都與過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的細胞凋亡有關[22-27]，而PTSD正是應激性精神障礙，其致病因素均屬于超強刺激，可能會使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過度。由此我們推斷:PTSD發(fā)病很可能也與過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有關。本課題組已有研究表明，PTSD大鼠內(nèi)側(cè)前額皮質(zhì)(medial prefrontal cortex，mPFC)神經(jīng)元出現(xiàn)細胞凋亡的改變，導致其結(jié)構(gòu)改變、體積縮小，引起功能下降，與PTSD的發(fā)病機制有一定關系[28,29]。鑒于IRE1-XBP1

10、通路及分子伴侶ERp29在UPR及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路細胞凋亡上的重要作用，我們將其作為了研究切入點，以深入探討PTSD的病理生理機制。
　　方法:
　　1、采用單一連續(xù)應激(Single-Prolonged Stress，SPS)方法刺激大鼠構(gòu)建PTSD大鼠模型，120只雄性Wistar大鼠被隨機分為5組:正常對照組、SPS1d組、SPS4d組、SPS7d組及SPS14d組;
　　2、觀察正常對照組和模型組大鼠的一般狀態(tài)，并隔

11、日測定大鼠體重，觀察體重增長變化;
　　3、采用Morries水迷宮測試SPS刺激后大鼠的空間記憶和學習能力的表現(xiàn)，包括定位航行實驗和空間探索實驗兩部分。
　　4、采用原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡變化;
　　5、采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測caspase-12 mRNA變化;
　　6、采用免疫熒光雙標、Western blotting及qRT-PCR檢測正常

12、對照組和模型組大鼠mPFC IRE1α和XBP1蛋白表達及mRNA分子水平表達;
　　7、采用免疫組織化學技術、Western blotting及qRT-PCR檢測正常對照組和模型組大鼠mPFC ERp29蛋白表達及mRNA分子水平表達。
　　結(jié)果:
　　一、PTSD大鼠一般情況及體重增長變化
　　SPS刺激后，大鼠表現(xiàn)出PTSD樣癥狀，如食欲不振、煩躁易怒等。同時，PTSD大鼠的體重增長明顯較正常對照組緩慢。<

13、br>　　二、PTSD大鼠行為學改變
　　Morries水迷宮定位航行實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠平均逃避潛伏期顯著高于正常對照組，同時空間探索實驗中模型組大鼠在目標象限停留的時間百分比明顯低于正常對照組。
　　三、PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡變化
　　TUNEL染色結(jié)果顯示PTSD大鼠mPFC中TUNEL陽性細胞數(shù)量隨時間延長而逐漸增多，于SPS刺激后第7d達到高峰，之后逐漸下降。
　　四、PTSD大鼠mPFC中

14、caspase-12 mRNA變化
　　qRT-PCR結(jié)果顯示SPS刺激后，caspase-12 mRNA水平明顯上調(diào)，于第7d達到高峰，之后逐漸下降。
　　五、PTSD大鼠mPFC中IRE1α和XBP1的表達變化
　　1、免疫熒光雙標結(jié)果
　　激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果顯示，正常對照組大鼠IRE1α和XBP1主要共表達于mPFC神經(jīng)元細胞質(zhì)中，SPS刺激后4d XBP1在細胞核中明顯表達。在SPS刺激后早期即出現(xiàn)

15、IRE1α和XBP1的表達增加，然后逐漸降低。
　　2、Western blotting檢測結(jié)果
　　IRE1α蛋白表達于SPS刺激1d后明顯增加，隨后逐漸下降，并于第14d完全消失。SPS刺激1d后，XBP1u蛋白表達水平顯著增加，隨后逐漸下降，而其活性形式XBP1 s于SPS刺激1d后明顯出現(xiàn)，并于第4d達到高峰。
　　3、qRT-PCR檢測結(jié)果
　　與Western blotting檢測結(jié)果相一致，SPS1

16、d組和SPS4d組IRE1α mRNA水平較正常對照組顯著升高。XBP1 mRNA水平在SPS刺激1d后明顯升高，隨后逐漸下降。
　　六、PTSD大鼠mPFC中ERp29的表達變化
　　1、免疫組織化學結(jié)果
　　SPS刺激后1d后，大鼠mPFC神經(jīng)元內(nèi)ERp29表達較正常對照組明顯增加，于第4d達到高峰，隨后逐漸下降。
　　2、Western blotting檢測結(jié)果
　　ERp29蛋白表達于SPS刺激1d

17、后明顯增加，于第4d達到高峰，隨后逐漸下降。
　　3、qRT-PCR檢測結(jié)果
　　與Westem blotting檢測結(jié)果相一致，ERp29 mRNA水平于SPS刺激1d后開始升高，于第4d達到高峰，隨后逐漸下降。
　　結(jié)論:
　　1、PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元出現(xiàn)細胞凋亡變化，作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路凋亡關鍵分子的caspase-12參與了PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元凋亡的調(diào)控。
　　2、IRE1α-XBP1通路介導