滋補(bǔ)脾陰方藥對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、本研究分別以N-糖鏈抑制劑衣霉素(tunicamycin，Tm)刺激小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(Neuro2a)創(chuàng)建ERS模型及以十字胞堿(staurosporine，STS)刺激Neuro2a細(xì)胞創(chuàng)建線粒體損傷模型，滋補(bǔ)脾陰方藥(Zi-Bu-Pi-YinDecoction，ZBPY)含藥血清為干預(yù)組，采用乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)(LactateDehydrogenaseLeakageAssays，LDHassays)檢測乳酸脫氫酶的泄漏率，用以表明細(xì)

2、胞損傷程度的變化；ERS模型同時(shí)使用RT-PCR方法觀察分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulatedprotein78，GRP78)mRNA、凋亡促進(jìn)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/EBPhomologousprotein，CHOP)mRNA的表達(dá)以探討滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清對ERS時(shí)神經(jīng)元死亡的影響及其機(jī)制以及對線粒體損傷時(shí)細(xì)胞死亡的影響；揭示滋補(bǔ)脾陰方藥對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑相關(guān)，為防

3、治腦老化、AD提供新的理論依據(jù)；通過血清藥理學(xué)的方法深入探討ZBPY方藥的藥效及作用機(jī)制。 研究方法： 1.正常培養(yǎng)Neuro2a細(xì)胞，細(xì)胞單層長至70～80﹪時(shí)給予終濃度為5μg/ml的Tm刺激，實(shí)驗(yàn)中設(shè)對照組、10﹪空白血清組、Tm(5μg/ml)組、5﹪、10﹪、15﹪ZBPY含藥血清組及10﹪空白血清、5﹪、10﹪、15﹪ZBPY含藥血清預(yù)處理組，刺激48h后收集細(xì)胞，用LDH釋放試驗(yàn)檢測LDH泄漏率，以觀察各組

4、細(xì)胞損傷程度的變化，確定ZBPY含藥血清對Tm引起的細(xì)胞損傷的作用及最佳作用濃度。 2.正常培養(yǎng)Neuro2a細(xì)胞，細(xì)胞單層長至90﹪時(shí)給予終濃度為5μg/ml的Tm刺激，實(shí)驗(yàn)分組同前，刺激6h后收集細(xì)胞，運(yùn)用RT-PCR法觀察GRP78mRNA、CHOPmRNA的表達(dá)。 3.正常培養(yǎng)Neuro2a細(xì)胞，細(xì)胞單層長至70～80﹪時(shí)給予終濃度為0.1μMSTS刺激，實(shí)驗(yàn)中設(shè)對照組、STS(0.1μM)組、15﹪空白血清及1

5、5﹪ZBPY含藥血清預(yù)處理組，刺激48h后收集細(xì)胞，用LDH釋放試驗(yàn)檢測LDH泄漏率，以觀察各組細(xì)胞損傷程度的變化，確定ZBPY含藥血清對STS引起的細(xì)胞損傷的作用。 研究結(jié)果： 1.各濃度血清組與對照組相比，LDH泄漏率沒有顯著性差異；Tm(5μg/ml)組與對照組相比，LDH泄漏率顯著升高，有顯著性差異(P＜0.01)；10﹪空白血清預(yù)處理組LDH泄漏率與Tm組相比沒有顯著性差異；而各濃度ZBPY含藥血清預(yù)處理組與T

6、m組相比LDH泄漏率下降明顯，有顯著性差異(P＜0.05)。10﹪藥物血清預(yù)處理組與10﹪空白血清預(yù)處理組相比有顯著性差異(P＜0.05)。 2.RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，Tm刺激6h后，CRP78mRNA及CHOPmRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，有顯著性差異(p＜0.05)；空白血清組及各濃度ZBPY藥物血清組與對照組相比CRP78mRNA及CHOPmRNA表達(dá)無顯著差異；各濃度ZBPY藥物血清預(yù)處理組CRP78mRNA及CH

7、OPmRNA與Tm組比有顯著性差異(p＜0.05)，而10﹪空白血清預(yù)處理組與Tm組比沒有顯著性差異；10﹪藥物血清預(yù)處理組與10﹪空白血清預(yù)處理組相比GRP78mRNA及CHOPmRNA表達(dá)有顯著性差異(p＜0.05)。 3.LDH釋放試驗(yàn)測定STS刺激細(xì)胞LDH泄漏率實(shí)驗(yàn)中，STS組與對照組相比LDH泄漏率明顯升高，有顯著性差異(p＜0.01)；15﹪空白血清預(yù)處理組與STS組相比LDH泄漏率下降有顯著性差異(p＜0.05)

8、，而15﹪ZBPY藥物血清預(yù)處理組LDH泄漏率與STS組相比LDH泄漏率下降有顯著差性異(p＜0.01)，15﹪ZBPY藥物血清預(yù)處理組與15﹪空白血清預(yù)處理組有顯著性差異(p＜0.05)。 研究結(jié)論： 1.滋補(bǔ)脾陰方藥對ERS引起的細(xì)胞損傷有顯著保護(hù)作用； 2.滋補(bǔ)脾陰方藥對ERS引起的細(xì)胞損傷保護(hù)作用的機(jī)制可能是減輕ERS的強(qiáng)度使得其對細(xì)胞的損傷程度下降以及抑制了部分ERS凋亡信號的傳導(dǎo)引起細(xì)胞死亡率的減少；