滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

1、<p>　　滋補(bǔ)脾陰方藥含藥血清對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究</p><p>　　作者：戰(zhàn)麗彬, 鐘軍華, 路小光, 隋華, 韋巍</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 內(nèi)質(zhì)網(wǎng); 衣霉素; 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78; 凋亡促進(jìn)因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白; 小鼠</p><p>　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum, ER）

2、廣泛存在于真核細(xì)胞中，是蛋白質(zhì)合成、折疊、運(yùn)輸以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子紊亂和未折疊蛋白質(zhì)蓄積可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS），發(fā)生具有保護(hù)作用的未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response, UPR）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激直接影響應(yīng)激細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸，如修復(fù)、損傷或凋亡。神經(jīng)系統(tǒng)許多疾病與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。最近的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能

3、與阿爾茨海默病（Alzheimer disease, AD）的發(fā)病有關(guān)。本研究觀察滋補(bǔ)脾陰方藥（Zibu Piyin Recipe, ZBPYR）含藥血清對(duì)由N糖鏈抑制劑衣霉素（tunicamycin, Tm）引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，以探討其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 滋補(bǔ)脾陰方藥由

4、清代吳澄《不居集》中資成湯加味而成，由紅參30 g，山藥15 g，茯苓15 g，白芍15 g，丹參12 g，白扁豆15 g，蓮肉20 g，石菖蒲10 g，遠(yuǎn)志10 g，檀香4.5 g，橘紅9 g，甘草9 g組成，均購(gòu)自大連醫(yī)藥集團(tuán)藥材公司。中藥常規(guī)水煎，每毫升中藥液含生藥3.29 g，4 ℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　1.2 主要試劑和儀器 達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modi

5、fied eagle's medium, DMEM)和胎牛血清，Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶和TRIReagent，Sigma公司產(chǎn)品；Tm，星形孢菌素（staurosporine, STS），日本W(wǎng)ako公司產(chǎn)品；細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，Roche公司產(chǎn)品；RNase OUT和Oligo (dt)，Invitrogen公司產(chǎn)品。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，Thermo Forma公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；UV75

6、4紫外分光光度計(jì)，上海分析儀器總廠產(chǎn)品；溫度梯度PCR擴(kuò)增儀，Thermo Hybaid公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，美國(guó)BIOTEKTM公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，UVP公司產(chǎn)品。</p><p>　　1.3 中藥血清制備 取健康雄性SD大鼠（220～250 ｇ）12只，隨機(jī)分為對(duì)照組和ZBPYR組，每組6只。適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后，ZBPYR組給予滋補(bǔ)脾陰方藥灌胃，10 ml/kg體質(zhì)量，此劑量灌胃2次/d，連續(xù)3 d；

7、對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃。于末次給藥后1 h腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h，2 000 r/min，4 ℃離心15 min分離血清，離心半徑為16.1 cm，56 ℃，30 min滅活。0.22 μm濾膜過濾除菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　1.4 Neuro2a細(xì)胞的培養(yǎng) 小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞Neuro2a細(xì)胞株由日本北海道大學(xué)藥學(xué)部野村靖幸教授惠贈(zèng)。細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后加入培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃培

8、養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞單層長(zhǎng)滿后用終濃度為0.25%胰蛋白酶37 ℃條件下消化3 min，以1∶3傳代。培養(yǎng)液含90% DMEM、10%胎牛血清和1％雙抗。細(xì)胞長(zhǎng)至第三代可以使用。</p><p>　　1.5 乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn) Neuro2a細(xì)胞接種后分為對(duì)照組、10％空白血清組、5％ZBPYR組、10％ZBPYR組、15％ZBPYR組、Tm（5 μg/ml）組、10％空白血清＋Tm（5 μg/ml）組、5％ ZB

9、PYR＋Tm（5 μg/ml）組、10％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）組、15％ ZBPYR＋Tm（5 μg/ml）組。細(xì)胞單層長(zhǎng)至70％時(shí)按以上分組給予相應(yīng)刺激。刺激后細(xì)胞放入5％CO2、37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）釋放試驗(yàn)檢測(cè)LDH泄漏率。LDH實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明執(zhí)行。LDH泄漏率為細(xì)胞上清中LDH活性與細(xì)胞總的LDH活性比值。LDH活性測(cè)定用酶標(biāo)儀于49

10、0 nm處檢測(cè)。另外Neuro2a細(xì)胞接種后分為對(duì)照組、STS（0.1 μmol/L）組、10％空白血清＋STS（0.1 μmol/L）組、15％ ZBPYR＋STS（0.1 μmol/L）組，待細(xì)胞單層長(zhǎng)至70％時(shí)按以上分組給予相應(yīng)刺激。刺激后細(xì)胞放入5％ CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測(cè)LDH泄漏率。</p><p>　　1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 實(shí)驗(yàn)分組同前。細(xì)胞單層長(zhǎng)至90％時(shí)按以上分

11、組給予相應(yīng)刺激。細(xì)胞放入5％ CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h。總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。（1）收集細(xì)胞用TRIReagent提取總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280，計(jì)算RNA濃度。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μl。取2 μg總RNA，加二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate, DEPC）水至總體積為9 μl，加0.5 μl Oligo (dt) 1218引物混合后，置70 ℃

12、變性10 min。然后加入下列成分：5×第一鏈緩沖液5.875 μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、0.1 mol/L DTT 2 μl、RNase抑制劑0.5 μl和逆轉(zhuǎn)錄酶0.125 μl，混合使反應(yīng)總體系為20 μl。放入46 ℃反應(yīng)1.5 h，70 ℃變性15 min，冰上5 min后進(jìn)行擴(kuò)增。（3）PCR反應(yīng)。在0.2 ml PCR管中加入1.2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、sd H2O 9 μl、10 mmol/L

13、 dNTP 0.24 μl、10×PCR緩沖液1.2 </p><p>　　表1 引物序列（略）</p><p>　　Table 1 Sequence of the primers</p><p>　　1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，圖像分析采用LabWorks 4.6專業(yè)圖像分析軟件。數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，兩組間差異比較采用

14、t檢驗(yàn)。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)ZBPYR含藥血清對(duì)Tm刺激Neuro2a后LDH泄漏率的影響 各濃度含藥血清和10%空白血清組與對(duì)照組相比，LDH泄漏率差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明血清對(duì)Neuro2a細(xì)胞沒有毒性作用；Tm（5 μg/ml）組與對(duì)照組相比，LDH泄漏率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

15、P＜0.01）；10％空白血清預(yù)處理組LDH泄漏率與Tm組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而各濃度ZBPYR含藥血清預(yù)處理組與Tm組相比，LDH泄漏率下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。10％藥物血清預(yù)處理組與10％空白血清預(yù)處理組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。</p><p>　　2.2 RTPCR方法觀察ZBPYR含藥血清對(duì)Tm刺激Neuro2a后GRP78 mRNA表達(dá)的影響 各濃度

16、含藥血清和10%空白血清組與對(duì)照組相比，GRP78 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明血清對(duì)Neuro2a細(xì)胞GRP78 mRNA表達(dá)沒有影響；Tm（5 μg/ml）組與對(duì)照組相比，GRP78 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)；而加入血清預(yù)處理1 h后再加入濃度為5 μg/ml Tm各組與Tm（5 μg/ml）組相比，GRP78 mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.05)，其中ZBPYR含藥血清預(yù)處理組GRP78 mRNA表達(dá)較空白血清預(yù)

17、處理組GRP78 mRNA表達(dá)下降更加明顯(P＜0.05)。見圖2。</p><p>　　2.3 RTPCR方法觀察ZBPYR含藥血清對(duì)Tm刺激Neuro2a后CHOP mRNA表達(dá)的影響 各濃度含藥血清組與對(duì)照組相比，CHOP mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明血清對(duì)Neuro2a細(xì)胞CHOP mRNA表達(dá)沒有影響；Tm（5 μg/ml）組與對(duì)照組相比，CHOP mRNA表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）；10％空

18、白血清預(yù)處理組與Tm（5 μg/ml）組相比，CHOP mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而各濃度ZBPYR含藥血清預(yù)處理組CHOP mRNA表達(dá)與Tm（5 μg/ml）組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；10％藥物血清預(yù)處理組與10％空白血清預(yù)處理組相比，CHOP mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。</p><p>　　圖1 LDH檢測(cè)Tm刺激細(xì)胞后各組細(xì)胞LDH泄漏率（略）</p

19、><p>　　Figure 1 LDH leakage from each group treated by Tm</p><p>　　**P＜0.01, vs normal control group; △P＜0.05, △△P＜0.01, vs Tmtreated group; ▲P＜0.05, vs 10％ control serumtreated group (n=4 for e

20、ach group).</p><p>　　圖2 RTPCR法觀察Tm刺激各組細(xì)胞后GRP78和CHOP mRNA表達(dá)（略）</p><p>　　Figure 2 Expressions of GRP78 and CHOP mRNAs in different groups treated by Tm (RTPCR)</p><p>　　Results of

21、 RTPCR electrophoresis from each group and values of IOD from each group (n=4 for each group). *P＜0.05, vs normal control group; △P＜0.05, vs Tmtreated group; ▲P＜0.05, vs 10％ control serumtreated group.</p><

22、p>　　2.4 LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)STS刺激Neuro2a后LDH泄漏率的變化 STS 0.1 μmol/L組與對(duì)照組比，LDH泄漏率升高（P＜0.01）；而加入15％空白血清預(yù)處理組與STS組相比，LDH泄漏率下降（P＜0.05）；15％ ZBPYR含藥血清預(yù)處理組與STS組相比，LDH泄漏率下降（P＜0.01）；15％ ZBPYR含藥血清預(yù)處理組與15％空白血清預(yù)處理組相比LDH泄漏率下降更加明顯（P＜0.05）。見圖3。

23、</p><p>　　圖3 LDH檢測(cè)STS刺激細(xì)胞后各組細(xì)胞LDH泄漏率（略）</p><p>　　Figure 3 LDH leakage from each group treated by STS</p><p>　　**P＜0.01, vs normal control group; △P＜0.05, △△P＜0.01, vs STStreated

24、group; ▲P＜0.05, vs 15％ control serumtreated group (n=4 for each group).</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　ERS是細(xì)胞的一種應(yīng)激反應(yīng)過程，糖饑餓、鈣平衡紊亂、糖基化抑制和二硫鍵合成減少等情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微環(huán)境發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的折疊受到影響，導(dǎo)致大量未折疊或錯(cuò)誤折

25、疊的蛋白質(zhì)堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，由此引起一系列以分子伴侶和折疊酶表達(dá)上調(diào)為標(biāo)志的應(yīng)答反應(yīng)，稱為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response, UPR）。通過UPR細(xì)胞才能在應(yīng)激情況下存活。分子伴侶GRP78與凋亡促進(jìn)因子CHOP是ERS時(shí)表達(dá)增多的兩種分子，被看作是ERS的標(biāo)志，在ERS中起著不同的作用。其中GRP78能保護(hù)細(xì)胞，而CHOP則是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此通過藥物干預(yù)后研究它們的表達(dá)情況可以進(jìn)一步了解藥物對(duì)ERS的

26、作用。AD是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，病理特征為淀粉樣蛋白的沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、tau蛋白異常磷酸化和區(qū)域選擇性神經(jīng)元死亡［1］。AD與基因突變有關(guān)，主要有編碼淀粉樣蛋白前體基因（amyloid protein precursor, APP）和早老素（presenilin, PS）基因，這些基因都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)。AD相關(guān)的早老素突變，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)并且通過改變APP的蛋白水解加工作用而部分地增強(qiáng)對(duì)</p><p&

27、gt;<b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　　1 Mattson MP. Pathways towards and away from Alzheimer's disease. Nature. 2004; 430(7000): 631639.</p><p>　　2 Nakagawa T, Zhu H, Morishima N, et al.

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