基于DIP病毒的腫瘤相關(guān)γ皰疹病毒-宿主拮抗機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　人類γ皰疹病毒與一些惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如EBV與Burkitt's淋巴瘤、霍奇金病、鼻咽癌(NPC)等相關(guān)，HHV-8/KSHV與卡波西肉瘤(KS)（AIDS病人中最常見的腫瘤）、原發(fā)性滲出性淋巴瘤(PEL)和多灶性卡斯特萊曼病(MCD)等相關(guān)。γ皰疹病毒感染宿主后，經(jīng)過急性裂解復(fù)制階段，可以快速被宿主清除但能通過多種免疫逃逸策略在宿主中建立潛伏感染，并終身存在宿主體內(nèi)。潛伏感染及免疫逃逸的存在使得被感染細(xì)胞容易

2、轉(zhuǎn)化，與惡性腫瘤形成密切相關(guān)。
　　EBV和KSHV為種屬特異性病毒，僅能感染人類和一些靈長類動(dòng)物，且無法建立有效的細(xì)胞感染模型。鼠皰疹病毒68(murine herpesvirus68，MHV-68)是從野生倉鼠中分離得到的一種γ皰疹病毒，與人類γ皰疹病毒高度同源，并可感染小鼠等模式動(dòng)物。因此，成為人類研究γ皰疹病毒與其宿主相互作用及探究各種γ皰疹病毒疫苗有效性的很有價(jià)值的模型。
　　RTA（replication and

3、 transcription activator，復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活化位點(diǎn)）是調(diào)節(jié)皰疹病毒從潛伏期進(jìn)入裂解復(fù)制的一個(gè)關(guān)鍵即刻早期基因產(chǎn)物。RTA在γ皰疹病毒中是保守的。RTA的表達(dá)可活化裂解復(fù)制相關(guān)基因，打破病毒潛伏狀態(tài)，促使病毒進(jìn)入裂解復(fù)制。RTA的持續(xù)表達(dá)則可抑制病毒建立潛伏感染。已知，在MHV-68基因組中，ORF73的產(chǎn)物可抑制RTA的表達(dá)和功能，敲除ORF73的病毒其潛伏感染能力下降。ORF72、M11和ORF74位于ORF73附近

4、，這些基因在病毒的潛伏期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，與病毒的潛伏感染及致瘤性密切相關(guān)。
　　與其他腫瘤相關(guān)皰疹病毒一樣，MHV-68存在多種免疫逃逸機(jī)制來抑制宿主的天然免疫和適應(yīng)性免疫。其ORF10、11、36、54可以抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生或者發(fā)揮作用，其M3基因具有泛素連接酶功能，能降低MHCⅠ類分子在感染細(xì)胞表面的表達(dá)，去除這些基因可提高宿主對病毒的識(shí)別及殺傷。
　　基于以上認(rèn)識(shí)，我們在MHV-68背景基礎(chǔ)上構(gòu)建了DIP(deficient

5、 in immuneevasion and persistence)重組病毒，該病毒去除了ORF10、11、36、54、 M3等抑制宿主免疫反應(yīng)的基因以及ORF72、73、74、M11等潛伏期相關(guān)基因并持續(xù)活化復(fù)制和轉(zhuǎn)錄激活蛋白(RTA)。小鼠接種試驗(yàn)表明DIP不會(huì)建立潛伏感染、并提供免疫保護(hù)作用。因此，將DIP作為一個(gè)“工具病毒”，研究該病毒的生物學(xué)特征及其刺激宿主所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，將有組于我們理解機(jī)體抗病毒免疫調(diào)控機(jī)制，并加深我們對

6、γ皰疹病毒潛伏感染和免疫逃逸的認(rèn)識(shí)。
　　本文的研究目的是通過對DIP病毒體內(nèi)復(fù)制特性和誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)的研究，尋找宿主調(diào)控病毒潛伏感染和免疫逃逸的可能機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)DIP MHV-68感染可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-γ。因此我們進(jìn)一步明確了IFN-γ對MHV-68裂解復(fù)制的作用和MHV-68抗IFN-γ的效應(yīng)及Ⅰ型干擾素在IFN-γ抗MHV-68感染過程中所起的作用。
　　方法和結(jié)果：
　　本文的第一部分我們對構(gòu)建的

7、DIP MHV-68在體內(nèi)的復(fù)制特性及宿主的免疫應(yīng)答進(jìn)行了研究。通過建立體內(nèi)感染模型:BALB/c小鼠經(jīng)鼻感染DIP MHV-68或者野生病毒，分別于感染后3天、6天和14天，收集肺組織或脾組織，通過plaque assay或者infectious center assay檢測病毒的裂解復(fù)制和潛伏感染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DIP無法在體內(nèi)建立裂解復(fù)制和潛伏感染。RT-qPCR動(dòng)態(tài)的檢測病毒基因和細(xì)胞炎癥因子、干擾素相關(guān)因子和一些細(xì)胞因子的表達(dá)，

8、發(fā)現(xiàn)DIP病毒感染后，病毒基因轉(zhuǎn)錄水平迅速升高，感染后第3天達(dá)到高峰，而后開始下降，于第6天降至較低的水平。而IFN-γ的表達(dá)量在第6天明顯高于野生病毒，炎癥因子IL-1β和TNF-α感染后第1天即達(dá)高峰，而后逐漸下降，至第6天與野生病毒相似。ELISA結(jié)果顯示DIP感染后第6天小鼠血清和肺泡灌洗液中IFN-γ分泌量明顯增高。以上研究結(jié)果提示我們，IFN-γ在MHV-68感染免疫中發(fā)揮了重要的作用，后面的研究內(nèi)容集中于IFN-γ與MHV

9、-68的相互作用展開。
　　本文的第二部分我們對IFN-γ在MHV-68裂解復(fù)制中的效應(yīng)進(jìn)行了研究。首先我們將野生MHV-68經(jīng)鼻感染W(wǎng)T和IFN-γR-/-小鼠，plaque assay和DNAPCR分別檢測病毒滴度和DNA拷貝數(shù)，結(jié)果顯示W(wǎng)T和IFN-γ R-/-小鼠之間沒有明顯的差別，病毒腹腔感染小鼠也出現(xiàn)同樣的結(jié)果。通過RT-qPCR和ELISA檢測野生病毒感染C57BL/6和BALB/c小鼠后IFN-γ的表達(dá)和分泌情況，

10、發(fā)現(xiàn)均產(chǎn)生極低的IFN-γ。而腹腔注射IFN-γ可以抑制腹腔感染病毒的復(fù)制。IFN-γ預(yù)處理BMM、RAW264.7、MEF、NIH3T3和MLE-12細(xì)胞可顯著抑制MHV-68在這些細(xì)胞的復(fù)制，表現(xiàn)為病毒滴度下降、DNA拷貝數(shù)下降、ORF50表達(dá)下降。提取IFN-γ R-/-小鼠的BMM細(xì)胞和PM細(xì)胞檢測IFN-γ的抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)IFN-γ抑制MHV-68的復(fù)制作用依賴IFN-γ受體的完整性。
　　本文的第三部分對Ⅰ型干擾素與

11、Ⅱ干擾素交互作用對IFN-γ抗病毒作用的影響及其機(jī)制進(jìn)行了研究。通過RT-qPCR和ELISA，我們發(fā)現(xiàn)IFN-γ預(yù)處理的BMM細(xì)胞感染MHV-68后可以誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá)和分泌。通過中和抗體抑制IFN-α明確分泌的IFN-α具有抑制MHV-68復(fù)制的活性。RT-qPCR結(jié)果顯示IFN-γ可以誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素下游ISGs的表達(dá)，包括MX1和IRF7。通過RT-qPCR檢測IFN-γ對Toll樣受體的調(diào)節(jié)作用顯示IFN-γ可以上調(diào)BMM細(xì)

12、胞上TLR9的表達(dá)，且上調(diào)作用依賴于IFN-γ受體和STAT1。Western blotting發(fā)現(xiàn)BMM細(xì)胞感染MHV-68后，IFN-γ上調(diào)TLR9可使IRF7磷酸化增強(qiáng)。抑制劑或者小干擾RNA抑制TLR9后，Ⅰ型干擾素產(chǎn)生明顯下降，伴隨著IFN-γ的抗病毒作用減弱。通過ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)p-STAT1不能與TLR9的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。
　　本文的第四部分，我們研究了病毒拮抗IFN-γ的作用及相關(guān)的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)MHV-

13、68感染BMM細(xì)胞可以誘導(dǎo)SOCS1產(chǎn)生，抑制STAT1的磷酸化從而抑制IFN-γ的抗病毒作用。通過檢測病毒的生長曲線，發(fā)現(xiàn)IFN-γ誘導(dǎo)的抗病毒作用在MHV-68感染的BMM細(xì)胞逐漸減弱，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)隨著感染時(shí)間延長，STAT1磷酸化水平被抑制。通過篩選JAK-STAT1負(fù)向調(diào)控因子發(fā)現(xiàn)MHV-68感染BMM細(xì)胞可以上調(diào)SOCS1的表達(dá)，且UV滅活的MHV-68無法誘導(dǎo)SOCS1產(chǎn)生。BMM細(xì)胞轉(zhuǎn)染SOCS

14、1特異性的siRNA可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，表現(xiàn)為IFN-γ的抗病毒作用增強(qiáng)且誘導(dǎo)的STAT1磷酸化持續(xù)活化。通過轉(zhuǎn)染TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9特異性的siRNA檢測SOCS1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)TLR3的表達(dá)，SOCS1產(chǎn)生明顯下降;且TLR3信號(hào)通路激動(dòng)劑poly(I∶C)可以誘導(dǎo)SOCS1的表達(dá);BMM細(xì)胞干擾或者敲除MyD88對SOCS1產(chǎn)生沒有影響。Western blotting檢測MHV-68感染后TLR3下游

15、信號(hào)通路活化情況，發(fā)現(xiàn)MHV-68感染BMM細(xì)胞可以活化NF-κB、p38、ERK、JNK信號(hào)通路。用這些信號(hào)通路的特異性抑制劑處理細(xì)胞后顯示只有抑制NF-κ B后，SOCS1產(chǎn)生下降。最后，我們?nèi)〔槐磉_(dá)TLR3的NIH3T3細(xì)胞，IFN-γ處理可以持續(xù)抑制MHV-68的復(fù)制，表現(xiàn)為病毒滴度持續(xù)下降，并且STAT1磷酸化水平保持穩(wěn)定。過表達(dá)SOCS1可使IFN-γ的抗病毒作用減弱，伴隨著STAT1磷酸化水平的下降。
　　結(jié)論：

16、r>　　1.DIP MHV-68病毒無法在BALB/c小鼠體內(nèi)建立裂解復(fù)制和潛伏感染并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的IFN-γ，說明IFN-γ可能在此過程中發(fā)揮了重要的作用且野生病毒存在抑制IFN-γ產(chǎn)生的機(jī)制。
　　2.IFN-γ可直接抑制MHV-68的復(fù)制且抑制效應(yīng)具有廣泛性:IFN-γ經(jīng)與IFN-γ受體結(jié)合，抑制MHV-68在巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的復(fù)制。
　　3.在BMM細(xì)胞，IFN-γ抑制MHV-68存在新的機(jī)制:I

17、FN-γ通過上調(diào)Toll樣受體9的表達(dá)，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，Ⅰ型干擾素與Ⅱ型干擾素協(xié)同發(fā)揮抗病毒的作用。
　　4.MHV-68利用宿主因素作為病毒拮抗IFN-γ的機(jī)制以利于病毒的存活:在BMM細(xì)胞，MHV-68感染活化TLR3-TRAF-NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生宿主性細(xì)胞因子SOCS1抑制STAT1磷酸化從而抑制IFN-γ的抗病毒效應(yīng)。
　　創(chuàng)新性：
　　1.以鼠γ皰疹病毒MHV-68為研究模型，率先構(gòu)建了一個(gè)裂解復(fù)制、

18、潛伏感染、免疫逃逸缺陷的重組病毒DIP。通過對該病毒的研究，有助于我們了解病毒潛伏感染、免疫逃逸機(jī)制及γ皰疹病毒如EBV、KSHV的致瘤機(jī)制。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)IFN-γ通過上調(diào)TLR9的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。我們的研究除了闡明IFN-γ抑制MHV-68裂解復(fù)制的機(jī)理外，還有助于了解Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素在腫瘤相關(guān)病毒感染過程中的相互關(guān)系。
　　3.闡明MHV-68感染BMM細(xì)胞可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生SOCS1來抑制IF