系統(tǒng)性紅斑狼瘡血漿microRNA表達譜篩查與驗證的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種病程反復(fù)的自身免疫性疾病，好發(fā)于育齡期的女性，主要表現(xiàn)在多個器官的受累，包括腎臟、皮膚、關(guān)節(jié)、血液和神經(jīng)系統(tǒng)等的炎癥反應(yīng)，疾病的活動情況會隨著時間出現(xiàn)波動，患者血清中會出現(xiàn)以抗核抗體為代表的多種自身抗體。我國的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，狼瘡的患病率高達70/10萬。系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種多因素的復(fù)雜病，其臨床表現(xiàn)多種多樣，多呈隱匿起病，臨

2、床癥狀因個人差異不盡相同，這表明SLE的發(fā)病機制可能涉及多個因素的相互作用。系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病因和發(fā)病機制至今尚未明確，目前的觀點普遍認為 SLE的致病因素包括自然環(huán)境因素（紫外線照射和化學(xué)物質(zhì)接觸等）、生物學(xué)環(huán)境（細菌、病毒感染等）、社會環(huán)境因素（壓力、精神創(chuàng)傷等）、基因易感性及內(nèi)分泌狀況等諸多方面。這些因素之間相互作用和影響，最終導(dǎo)致SLE病人體內(nèi)的免疫功能紊亂?，F(xiàn)在針對SLE的治療仍然是一個很大的爭論，雖然可緩解病情和提高病人生活

3、質(zhì)量的治療藥物被不斷的研發(fā)出來，但仍然沒有一個確定的特異性治療方法，還有大量病人的癥狀仍然無法得到徹底或有效的控制，而且長期的炎癥和與藥物有關(guān)的副作用可能會造成永久性的器官損傷，這與該病預(yù)后的生命質(zhì)量下降以及死亡率的上升是密切相關(guān)的。因此對系統(tǒng)性紅斑狼瘡病因及發(fā)病機制的研究就顯得尤為重要。已有研究表明，輔助性T細胞（Th）在SLE及其它自身免疫疾病的發(fā)病中起重要作用。從免疫學(xué)上講，SLE是自身免疫耐受損傷和自身抗原介導(dǎo)的T、B淋巴細胞過

4、度活化所導(dǎo)致的。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是一類含有約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過與靶 mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)互補配對，從而造成 mRNA降解或蛋白質(zhì)的表達受到抑制，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控。人類大約有30％編碼蛋白的基因受miRNAs調(diào)節(jié)，包括凋亡、細胞分化和分裂、脂代謝、造血和病毒防御等。有研究表明，miR-326能夠通過抑制Ets-1轉(zhuǎn)錄因子，進而促進輔助性T細胞17(Th17)的

5、分化；并且miR-326表達水平與自身免疫性疾病的疾病活動度顯著相關(guān)。而本課題組已通過前期研究證實，Th17及其相關(guān)細胞因子參與了SLE的發(fā)病，并首次提出Th17可能作為SLE的治療靶點。此外，課題組參與的兩項全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)證實Ets-1是SLE的易感基因。由此，我們提出了Ets-1在SLE中可能的作用通路。據(jù)此推測miRNA可能通過調(diào)控一些關(guān)鍵的靶基因，從而在SLE的發(fā)病中起重要作用。已有文獻報道多個miRNA與自身免疫性疾病有

6、關(guān)，它們是否也參與SLE的發(fā)病尚不清楚。
　　血漿miRNA具有含量豐富、性質(zhì)穩(wěn)定、易于檢測等特征，已作為一類新型生物標志物用于腫瘤等慢性非傳染性疾病的早期篩查、診斷和預(yù)后評估研究，但在 SLE中多為在外周血單核細胞（PBMC）中的表達研究，對 SLE患者血漿miRNA表達譜的報道較少。
　　近年有研究表明 microRNA-101通過靶向調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinas

7、es，MAPKs）mRNA的3’UTR區(qū)來控制MAPK的水平，同時影響其下游細胞因子的分泌。MAPK信號通路調(diào)節(jié)眾多與SLE發(fā)病相關(guān)的細胞因子，例如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-a）、白細胞介素1（interleukin1，IL-1）、白細胞介素6（interleukin6，IL-6）和干擾素（interferon，IFN）等等，它們都在SLE的發(fā)病中都扮演著至關(guān)重要的角色。有研究顯示，

8、miRNA是通過結(jié)合靶mRNA的3'UTR區(qū)域從而實現(xiàn)對其表達的調(diào)控，無論是IL-6還是TNF-a，它們的3' UTR區(qū)域中都含有microRNA-16的結(jié)合位點。此外，許多研究均顯示microRNA-16的過表達會使IL-6、IL-8和TGF-β的表達量下降。因此，我們意圖通過ELISA檢測IL-6、IL-17和TNF-a的表達量是否與miR-16-5p和miR-101-3p的表達相關(guān)。
　　基于以上，本研究擬通過miRNA芯片

9、檢測SLE患者和正常對照血漿miRNA表達水平，并進行獨立驗證，結(jié)合人口統(tǒng)計學(xué)資料和臨床資料，建立 SLE及不同臨床亞型的血漿miRNA表達譜，初步探討相關(guān)miRNA在SLE發(fā)病中的分子機制。之后探討某些經(jīng)過驗證異常表達的miRNAs與三種細胞因子IL-6、IL-17和TNF-α的相關(guān)。本研究的完成將有助于確定SLE診斷和疾病分型的生物學(xué)標記，為最終發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究一、SLE患者血漿microRNA的差異表

10、達及驗證
　　目的：
　　篩查并驗證系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血漿 microRNA表達譜，探討microRNA的表達與SLE發(fā)病及其病程的關(guān)聯(lián)性，為SLE的發(fā)病機制研究、早期預(yù)警、新的治療方向提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　本項目采用病例對照研究，通過收集 SLE患者和正常對照的血液標本，利用miRNA芯片檢測其血漿miRNA表達水平，并利用Real-time PCR方法進行獨立驗證，結(jié)合人口統(tǒng)計學(xué)資料和臨床資料，建

11、立 SLE及不同臨床亞型的血漿miRNA表達譜，探討異常表達的 miRNAs與 SLE患者臨床特征間的關(guān)聯(lián)。從2012年10月開始收集新發(fā)SLE病例的血液標本備用。SLE病例主要來自于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科和安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科?；颊叻?997年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）的SLE分類標準；選擇年齡、性別與SLE患者匹配的正常人作為對照組。第一階段擬收集SLE新發(fā)病例和對照各30例，用于miRNA芯片檢測血漿中m

12、iRNA的表達水平；第二階段擬重新收集SLE新發(fā)病例38例和對照40例，進行獨立驗證。
　　miRNA芯片檢測數(shù)據(jù)使用GenePixpro6.0提取分析，驗證實驗使用Real-time PCR方法檢測miR-16-5p和miR-101-3p表達量，以2-ΔCt表示目的miRNA相對表達量。使用Epi Data3.1建庫，雙人錄入資料，專人抽查核實。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS10.01軟件進行處理與統(tǒng)計分析，檢驗水準α=0.05。

13、>　　結(jié)果：
　　（1）miRNA芯片的篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SLE患者血漿中共篩選出97個基因表達上調(diào)，182個基因表達下調(diào)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，最終篩選出差異表達的人類miRNAs有158個，其中表達上調(diào)有32個基因，表達下調(diào)有126個基因。
　?。?）擴大樣本量，設(shè)計引物對差異表達的人類 miRNAs其中的2個microRNAs:miR-16-5p和miR-101-3p在SLE患者和正常對照中的表達水平進行Re

14、al-time PCR驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-16-5p和miR-101-3p在SLE患者血漿中的表達差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P分別為0.001和0.005），與 miRNA芯片篩查預(yù)測的結(jié)果一致。
　?。?）miR-16-5p和miR-101-3p血漿表達水平與SLE患者主要臨床特征和實驗室檢測指標的關(guān)聯(lián)研究中，發(fā)現(xiàn)皮疹陽性組與陰性組間、血小板降低組與非血小板降低組間的miR-16-5p和miR-101-3p表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義

15、，統(tǒng)計量和P值分別為Z皮疹=-2.368，P皮疹=0.017；Z血小板降低=-2.146，P血小板降低=0.032和Z皮疹=-2.046，P皮疹=0.041；Z血小板降低=-2.180，P血小板降低=0.029。
　?。?）血漿中miR-16-5p和miR-101-3p的表達水平與SLE患者疾病活動度的關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)SLE患者疾病活動度評分與miR-16-5p和miR-101-3p表達水平的相關(guān)性均無統(tǒng)計學(xué)意義（均有P＞0.05）

16、。
　?。?）SLE患者血漿中miR-16-5p、miR-101-3p表達水平的相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-16-5p表達水平與miR-101-3p表達水平呈正相關(guān)（r=0.675，P<0.001）。
　　結(jié)論：
　　在 SLE患者血漿 miRNA芯片的篩查中，最終篩選出差異表達的人類miRNAs有158個，其中表達上調(diào)的有32個基因，表達下調(diào)有126個基因。對miR-16-5p、miR-101-3p的Real-tim

17、e PCR實驗驗證結(jié)果與芯片篩查結(jié)果相符。在對血漿miR-16-5p和miR-101-3p表達水平與SLE患者臨床癥狀和實驗室指標的分析中，顯示miR-16-5p和miR-101-3p的表達均與皮疹和血小板降低相關(guān)，提示這兩個 miRNAs可以作為潛在的診斷、判斷疾病預(yù)后或是復(fù)發(fā)情況的分子標志物。
　　研究二、SLE患者血漿中miR-16-5p和miR-101-3p表達水平與IL-6、IL-17和TNF-α水平的相關(guān)性研究

18、　　目的：
　　研究miR-16-5p和miR-101-3p在SLE患者血漿中的表達水平與IL-6、IL-17和TNF-α水平的關(guān)聯(lián)性，探討在 SLE發(fā)病及其病程發(fā)展中這3種細胞因子與miR-16-5p和miR-101-3p的相互作用。
　　方法：
　　研究對象 SLE患者的選取標準同研究一，與研究一來源于同一樣本人群。ELISA實驗最終檢測的樣本量為37例患者。SLE患者資料收集的內(nèi)容和方法同研究一。在獲得研究對象知

19、情同意后，使用EDTA抗凝采血管抽取所有研究對象外周靜脈血5ml，3小時內(nèi)進行分離血漿處理。同時由專業(yè)人員對研究對象進行問卷調(diào)查，收集研究對象的一般情況和臨床資料，并進行 SLE疾病活動指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）評分。采用ELISA試劑盒檢測血漿中IL-6、IL-17和TNF-α的水平，對SLE患者中狼瘡腎炎患者和非狼瘡腎炎患者、疾病活動期

20、患者和非疾病活動期患者之間血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平的差異及其與miR-16-5p和miR-101-3p在SLE患者血漿中表達水平的相關(guān)性進行分析。采用SPSS10.01軟件進行統(tǒng)計分析，檢驗水準α=0.05。
　　結(jié)果：
　　（1）SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α的水平 IL-6的血漿濃度為（18.15±7.82）pg/mL，IL-17的血漿濃度為（20.42±10.11）pg/mL，TNF-

21、α的血漿濃度為（33.66±15.18）pg/mL。
　　（2）SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α的水平與SLE患者主要臨床特征和實驗室檢測指標的關(guān)聯(lián) SLE患者管型尿與非管型尿組間的血漿 IL-6水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.388，P=0.009）；肌炎和非肌炎組、血小板降低組和血小板未降低組間的血漿IL-17水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t肌炎=-5.354，P肌炎<0.001；t血小板降低=-2.267，P血小板降低

22、=0.030）；盤狀紅斑和非盤狀紅斑組間的TNF-α血漿水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.499，P<0.001）。
　?。?）SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α血漿水平與SLE患者疾病活動度的關(guān)聯(lián) SLE患者血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與其疾病活動度的關(guān)聯(lián)均無統(tǒng)計學(xué)意義（均有P＞0.05）。
　　（4）SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α水平與miR-16-5p表達水平的相關(guān)性 SLE患者

23、血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與miR-16-5p表達水平的相關(guān)性均無統(tǒng)計學(xué)意義（均有P＞0.05）；不同臨床癥狀間、不同實驗室檢測指標間的比較顯示，SLE患者非顴部紅斑組血漿TNF-α水平與miR-16-5p表達水平呈正相關(guān)（r=0.928，P<0.001），關(guān)節(jié)炎組（r=-0.486，P=0.014）、抗Ribosomal P陽性組血漿TNF-α水平與miR-16-5p表達水平呈負相關(guān)（r=-0.488，P=0.047）。

24、
　　（5）SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α水平與miR-101-3p表達水平的相關(guān)性 SLE患者血漿中miR-101-3p表達水平與 IL-17水平呈正相關(guān)（r=0.329,P=0.047）；盤狀紅斑陰性組、低補體陽性組、抗核抗體陽性組血漿IL-17水平與miR-101-3p表達水平呈正相關(guān)（均有P<0.05），管型尿陰性組、蛋白尿陰性組、膿尿陰性組、抗Ribosomal P陰性組IL-17血漿水平與miR-10

25、1-3p表達水平呈負相關(guān)（均有P<0.05）；抗Ribosomal P陰性組血漿TNF-α水平與miR-101-3p表達水平呈正相關(guān)（r=0.448，P=0.048）。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿IL-17水平與miR-101-3p表達水平相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與miR-16-5p表達水平相關(guān)，但是血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與miR-16-5p和miR-10