降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝形成的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、隨著肥胖、高脂血癥、2型糖尿病和代謝綜合征等疾病在全世界范圍的流行，非酒精性脂肪性肝（NAFLD）的發(fā)病率也不斷上升。近期研究表明，經(jīng)過(guò)4~13年后大約50％的NAFLD患者發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎（NASH），40%的發(fā)展為肝纖維化。NAFLD的病理生理過(guò)程極為復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制仍不明確，并且目前沒(méi)有有效的治療方法，NASH的預(yù)后也不容樂(lè)觀。因此，非常有必要對(duì)非酒精性脂肪肝患者制定有效的干預(yù)措施。
　　NAFLD患者常伴有肥胖、胰島

2、素抵抗，但并不是所有的肥胖者都可以發(fā)展為NAFLD，腸道因素在NAFLD的致病機(jī)制中發(fā)揮了很大作用。研究顯示，腸道內(nèi)的革蘭氏陰性菌產(chǎn)生腸源性?xún)?nèi)毒素（LPS），它們經(jīng)門(mén)靜脈輸送到肝臟，當(dāng)腸道菌群失衡時(shí)，大量的革蘭氏陰性菌增殖并產(chǎn)生內(nèi)毒素，就會(huì)導(dǎo)致患者發(fā)生代謝紊亂，肥胖，糖尿病，NAFLD以及NASH。在對(duì)急性肝損傷小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腸粘膜通透性增強(qiáng)和細(xì)菌移位，并出現(xiàn)腸道菌群的改變。此外，在對(duì)NAFLD患者以及動(dòng)物模型的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，

3、其循環(huán)內(nèi)毒素水平都明顯高于正常水平，還存在著小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，腸粘膜通透性增加的現(xiàn)象。由于腸道菌群和肥胖、胰島素抵抗、NAFLD密切相關(guān)，所以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)有可能起到防治NAFLD的作用。
　　益生菌和中藥均可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群改善NAFLD。已經(jīng)有研究顯示，益生菌具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡和降低機(jī)體膽固醇水平的作用，許多益生菌被制作成酸奶供高脂血癥和NAFLD患者食用。此外，決明子作為一種具有抑制脂肪積累的天然功能性食品添加劑

4、，在改善肥胖,胰島素抵抗等代謝疾病中取得了良好的效果，這為NAFLD的治療提供了新的方向。決明子是豆科一年生草本植物，廣泛種植于熱帶亞洲國(guó)家，其主要有效成分為蒽醌類(lèi)化合物，包括：決明素、大黃素、蘆薈大黃素等。它的草本成分被作為一種功能性飲料在該地區(qū)流行，并且具有降血脂，降膽固醇，抗氧化，抗真菌，保護(hù)神經(jīng)功能等生理效應(yīng)。決明子不僅對(duì)急性肝損傷大鼠肝功能有保護(hù)作用，而且可以通過(guò)上調(diào)AMP依賴(lài)的蛋白激酶，從而改善肥胖、胰島素抵抗以及NAFLD

5、。
　　雖然，益生菌和決明子均具有改善肥胖、胰島素抵抗、NAFLD等代謝疾病的效果，但是益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌是否可以提高NAFLD的防治效果仍不明確。綜上所述，我們假設(shè)益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌可以更好的改善NAFLD，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)以及肝臟的能量代謝有關(guān)。為了驗(yàn)證上述假設(shè)，我們擬通過(guò)體外篩選和鑒定具有明確降脂效果的益生菌菌株，并與決明子蒽醌進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，驗(yàn)證其降脂效率的變化。再將篩選出的降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對(duì)高

6、脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠進(jìn)行干預(yù)，并驗(yàn)證干預(yù)效果。
　　第一部分降脂益生菌的體外篩選及生物學(xué)特性研究
　　目的：
　　前期我們使用硫酸鐵銨法，從健康人體以及傳統(tǒng)發(fā)酵食物中，篩選出了具有高效降膽固醇的菌株（體外降膽固醇效率>50%）。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步評(píng)估其降甘油三酯的能力，以及耐酸、耐膽鹽、耐胃蛋白酶、耐胰蛋白酶、細(xì)胞黏附性等生物學(xué)特性，并聯(lián)合決明子總蒽醌共培養(yǎng)，了解其降脂效率的變化，選出最優(yōu)菌株為下一步實(shí)驗(yàn)打下

7、基礎(chǔ)。
　　材料與方法：
　　1.降膽固醇菌株與決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng)，在MRS膽固醇培養(yǎng)基中，使用硫酸鐵銨法對(duì)其降膽固醇效率進(jìn)行檢測(cè)，并比較前后降膽固醇效率的變化。
　　2.在MRS甘油三酯培養(yǎng)基中，對(duì)降膽固醇菌株以及其和決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng)的降脂效率進(jìn)行檢測(cè)，并比較降甘油三酯效率的變化。
　　3.對(duì)菌株進(jìn)行耐受胃酸、耐受膽鹽、耐受胃蛋白酶、耐受胰蛋白酶、細(xì)胞黏附性實(shí)驗(yàn)，評(píng)估其生物學(xué)特性。
　　4.將篩選出

8、的最優(yōu)菌株進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)，并提取DNA進(jìn)行菌種鑒定。
　　結(jié)果：
　　1.降膽固醇菌株聯(lián)合決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng)后，降膽固醇效率均有所提升，其中以DM9054、DM9073、86066前后降解效率提高最為顯著(P<0.05)。
　　2.降膽固醇菌株聯(lián)合決明子總蒽醌聯(lián)合培養(yǎng)后，菌株8503、84034、86066降甘油三酯提高最為顯著(P<0.05)。
　　3.菌株DM9054和86066具有較好的耐胃酸能力，菌株DM

9、9007、DM9054、86066有較好的耐膽鹽能力，DM9054和86066有較好的胃蛋白酶耐受能力，各個(gè)菌株對(duì)胰蛋白酶均有很好耐受力；相對(duì)于其他菌株，菌株DM9007、DM9054、86066細(xì)胞黏附性最強(qiáng)(P<0.05)。
　　4.最優(yōu)菌株為 DM9054、86066，檢測(cè)無(wú)質(zhì)粒存在，經(jīng)過(guò)16SrDNA測(cè)序比對(duì)，DM9054為鼠李糖乳桿菌、86066為植物乳桿菌。
　　結(jié)論：
　　DM9054為鼠李糖乳桿菌、86

10、066為植物乳桿菌，均為益生菌，并且其聯(lián)合決明子總蒽醌培養(yǎng)可以提高降解膽固醇和甘油三酯的效率，起到協(xié)同作用。同時(shí)，菌株具有較好的耐受消化液以及對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附能力，并不帶有質(zhì)粒。
　　第二部分降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠脂代謝及相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　目的：
　　通過(guò)篩選出的降脂益生菌 DM9054、86066，并聯(lián)合具有協(xié)同降脂作用的決明子總蒽醌，共同干預(yù)NAFLD大鼠，分析其對(duì)脂代謝過(guò)程中相關(guān)基

11、因和蛋白表達(dá)情況，以期發(fā)現(xiàn)降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌可能在脂代謝通路中的作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步探討其改善NAFLD的機(jī)制。
　　材料與方法：
　　1. SD大鼠隨機(jī)分為5組，分別給予正常飲食（ND），高脂飲食（HFD），高脂飲食+決明子總蒽醌0.2g/kg（HFD+AC），高脂飲食+高效降膽固醇益生菌2×1010 CFU/mL（HFD+P），高脂飲食+決明子總蒽醌+益生菌（HFD+TAC+P），所有分組大鼠連續(xù)干預(yù)150天后處死。

12、
　　2.評(píng)估各組大鼠一般情況，以及體重、Lee's指數(shù)及肝指數(shù)變化。
　　3.檢測(cè)各組大鼠血脂水平、胰島素抵抗情況，評(píng)估血清內(nèi)毒素和肝臟TNF-α水平，并通過(guò)HE和油紅O染色觀察各組大鼠肝臟病理學(xué)改變。
　　4.檢測(cè)大鼠肝臟 CYP7A1、HMGCR、LDLR mRNA表達(dá)水平，以及腸道FXR mRNA表達(dá)水平，Western-Bloting檢測(cè)肝臟PPAR-α、PPAR-γ、SREBP-1c蛋白表達(dá)水平。
　

13、　結(jié)果：
　　1.連續(xù)150天高脂飲食誘導(dǎo)，成功建立了非酒精性脂肪肝大鼠模型。
　　2.各組大鼠生命體征平穩(wěn)，高脂飲食組大鼠體重、Lee's指數(shù)及肝指數(shù)較其余各組顯著增加(P<0.05)，通過(guò)降脂益生菌、決明子總蒽醌以及其聯(lián)合應(yīng)用，均可以顯著降低大鼠體重、Lee's指數(shù)及肝指數(shù)(P<0.05)。
　　3.高脂飲食組大鼠TC、TG、LDL、FFA、胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)、血清內(nèi)毒素以及肝臟TNF-α水平，較其余各組均顯著升高(P

14、<0.05)，而HDL則顯著降低（P<0.05），并且肝臟HE和油紅O染色可見(jiàn)明顯脂肪變性以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。使用降脂益生菌、決明子總蒽醌以及聯(lián)合應(yīng)用干預(yù)后，均顯著降低了 TC、TG、LDL、FFA，胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)、血清內(nèi)毒素以及肝臟TNF-α水平，并升高了HDL(P<0.05)，肝臟病理觀察，不同程度改善了肝臟脂肪變性以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度。
　　4.與高脂飲食組相比，通過(guò)降脂益生菌、決明子總蒽醌以及二者聯(lián)合應(yīng)用的干預(yù)，顯著上調(diào)了肝臟

15、CYP7A1、LDLR mRNA，PPAR-α蛋白和腸道 FXR mRNA的表達(dá)，并下調(diào)肝臟中HMGCR mRNA以及SREBP-1c、PPAR-γ蛋白的表達(dá)(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　降脂益生菌和決明子總蒽醌可以通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠血脂水平，以及脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠，而且二者聯(lián)合應(yīng)用效果最為顯著。其具體機(jī)制可能是：通過(guò)上調(diào)肝臟中CYP7A1、LDLR mRNA，以及腸道FXR mRNA的表

16、達(dá)，并抑制SREBP-1c的生成，促進(jìn)膽固醇吸收和排泄。并下調(diào)肝臟中HMGCR mRNA的表達(dá)，減少膽固醇合成。同時(shí)促進(jìn)肝臟中PPAR-α的表達(dá)，抑制PPAR-γ的表達(dá)，促進(jìn)膽固醇代謝，減少其外流的作用。從而調(diào)節(jié)了大鼠血脂代謝水平，改善了胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，并降低了肝臟炎癥因子和腸源性?xún)?nèi)毒素的釋放。
　　第三部分降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及腸黏膜屏障功能的影響
　　目的：
　　腸道菌群結(jié)構(gòu)和

17、腸黏膜屏障功能在NAFLD發(fā)病過(guò)程中起重要作用。因此，在第二部分研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討降脂益生菌、決明子總蒽醌以及其聯(lián)合應(yīng)用，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和腸黏膜屏障完整性改善NAFLD的作用機(jī)制。
　　材料與方法：
　　1.通過(guò)糞便 DNA提取試劑盒提取各組大鼠糞便樣本 DNA，并對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步對(duì)V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。
　　2.通過(guò)Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)大鼠腸道50、100、15

18、0天樣本進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)序列進(jìn)行修剪和分類(lèi)，獲取優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行分析。
　　3.根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)各組大鼠腸道菌群組成、物種豐度差異以及各組腸道菌群結(jié)構(gòu)的組間相似性進(jìn)行分析。
　　4.病理切片觀察各組大鼠腸黏膜情況，Western-Blotting檢測(cè)腸黏膜緊密連接蛋白Occludin以及ZO-1表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)各組大鼠糞便樣本提取總DNA質(zhì)量檢測(cè)，OD260/OD280總體值均在1.8~2.0之間，并

19、使用V4區(qū)引物，成功擴(kuò)增出條帶。
　　2.通過(guò)Illumina Miseq高通量測(cè)序共得到7,583,846條序列信息，經(jīng)過(guò)修剪和篩選獲得5,740,971條優(yōu)質(zhì)序列，優(yōu)質(zhì)序列比例為75.7%，平均每個(gè)樣本63,788條，序列長(zhǎng)度均在225~226bp之間。并且從序列的稀釋曲線可以看出足夠覆蓋腸道微生物中97%以上的菌種，且豐度分布均勻。
　　3.對(duì)各組大鼠腸道菌群組成分析發(fā)現(xiàn)，高脂飲食組腸道厚壁菌門(mén)比例增加顯著，并且擬桿菌

20、門(mén)比例顯著減少。在分析大鼠腸道微生物屬水平時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)與正常飲食組相比，高脂飲食大鼠腸道擬桿菌屬、乳酸菌屬、變性菌屬豐度均顯著降低，而顫螺旋菌屬豐度卻顯著升高（P<0.05）。通過(guò)降脂益生菌和決明子總蒽醌干預(yù)，升高了擬桿菌屬、乳酸菌屬、變性菌屬豐度，并降低了顫螺旋菌屬豐度（P<0.05）。降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌效果最為顯著。對(duì)各組大鼠腸道微生物的組成以及相似性，進(jìn)行了PCoA分析和聚類(lèi)分析。結(jié)果顯示通過(guò)降脂益生菌聯(lián)合決明子總蒽醌干預(yù)

21、的大鼠，腸道菌群結(jié)構(gòu)最接近于正常。熱圖的聚類(lèi)分析也進(jìn)一步證實(shí)了此結(jié)果。
　　4.病理觀察發(fā)現(xiàn)高脂飲食組大鼠小腸絨毛出現(xiàn)斷裂，缺失，間隙增寬，上皮細(xì)胞壞死、脫落的現(xiàn)象；并且腸道緊密連接蛋白Occludin以及ZO-1表達(dá)量較其它各組顯著降低（P<0.05）。而通過(guò)降脂益生菌、決明子總蒽醌以及其聯(lián)合應(yīng)用干預(yù)后，各干預(yù)組絨毛排列較為整齊，缺失斷裂減少，形態(tài)有所恢復(fù)；還增加了腸道緊密連接蛋白Occludin以及ZO-1表達(dá)量（P<0.05