榅桲提取物抗人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的初步研究.pdf

1、目的：本研究采用H2O2建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型，探討榅桲提取物對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的氧化損傷和凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)HUVEC，通過酶消化法對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC進(jìn)行消化傳代，建立過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞體外氧化損傷模型。采用Savage法脫蛋白，蒽酮-硫酸法對榅桲提取物進(jìn)行分離純化，含量測定，以不同濃度的榅桲提取物作用于HUVEC細(xì)胞

2、，實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對照組、H2O2氧化損傷模型組(10μmoL/L)、榅桲總黃酮(TFCOM)低濃度(10μg/mL)、中濃度(20μg/mL)、高濃度(40μg/mL)、榅桲多糖(PCOM)低濃度(15μg/mL)、榅桲多糖中濃度(30μg/mL)、榅桲多糖高濃度(60μg/mL)預(yù)處理24h后加H2O2損傷4h。在建立H2O2氧化損傷模型的基礎(chǔ)上，通過形態(tài)學(xué)觀察和MTT法測定HUVEC細(xì)胞的存活率的影響，進(jìn)一步確定榅桲提取物對 H2O2所

3、致的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果。AnnexinV-FITC/7-AAD雙染流式細(xì)胞儀檢測榅桲提取物對HUVEC細(xì)胞周期變化和細(xì)胞凋亡情況的影響，通過Hochest33258熒光染色法檢測榅桲提取物防止HUVEC細(xì)胞遭受H2O2損傷在細(xì)胞形態(tài)上的變化特征；DCFH-DA活性檢測試劑盒來檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的表達(dá)水平，試劑盒測定細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活力，丙二醛(MDA)的含量，乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量，Real-T

4、ime PCR檢測Bax，Bcl-2，caspase-3 mRNA的表達(dá)，蛋白印跡(Western Blot)法檢測Bax，Bcl-2，caspase-3蛋白的表達(dá)。觀察榅桲提取物對H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞氧化損傷的影響。
　　結(jié)果：與正常對照組比較，經(jīng)10μmoL/L H2O2刺激后細(xì)胞活性明顯降低，H2O2可引起G0/G1期細(xì)胞比例增高，S期細(xì)胞比例下降，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)SOD活性降低、MD

5、A含量升高、LDH漏出量增加(P<0.05)、細(xì)胞內(nèi)抗凋亡的Bcl-2基因mRNA水平下降，促凋亡的Bax和caspase-3基因mRNA水平上升；加入不同濃度的TFCOM和PCOM干預(yù)后可對抗H2O2引起的這種變化。與模型組相比，榅桲提取物各處理組細(xì)胞存活率明顯增加(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例均有所下降，S期細(xì)胞和G2/M期細(xì)胞比例有不同程度增加，細(xì)胞凋亡率明顯降低SOD活力明顯增強(qiáng)，MDA的含量和LDH的漏出量明顯降低(P