KNDC1過表達(dá)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:本研究將通過內(nèi)皮細(xì)胞KNDC1過表達(dá)方法，確認(rèn)其在內(nèi)皮細(xì)胞衰老中的作用，并進(jìn)一步對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　方法:1.細(xì)胞培養(yǎng):實(shí)驗(yàn)所用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由新生兒臍帶分離獲得，臍帶由北京某三甲醫(yī)院產(chǎn)科提供，細(xì)胞分離后，加入含20％胎牛血清的ECM培養(yǎng)液，放入5％ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)中37℃培養(yǎng)。首次獲得的細(xì)胞為第0代，第一次傳代后獲得的細(xì)胞為第一代。培養(yǎng)液2-3天更換一次，當(dāng)細(xì)胞增殖到80-90％融合度時(shí)，使用0.125％胰蛋白酶

2、進(jìn)行1∶3傳代。根據(jù)我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇第6-10代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并培養(yǎng)在六孔板中。
　　2.腺病毒轉(zhuǎn)染:KNDC1腺病毒交由Santa Cruz Biotechnology公司合成。選擇第6代內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染KNDC1腺病毒，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（空白腺病毒），并培養(yǎng)24小時(shí)。分組情況為:(1)C，空白對(duì)照組;(2)A，陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空白腺病毒;(3)K30/60/90，實(shí)驗(yàn)組，分別轉(zhuǎn)染劑量為30/60/90 epu

3、/cell的KNDC1腺病毒。
　　3.mRNA表達(dá)分析:內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)上述處理后，用TRIZOI試劑提取每組細(xì)胞總RNA，使用SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒，通過qPCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的KNDC1的mRNA的表達(dá)。在檢測(cè)過程中以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照。并且以GAPDH為內(nèi)參，使用CT值計(jì)量mRNA相對(duì)表達(dá)量。CT值的含義是:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。因此每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝

4、數(shù)存在負(fù)性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。使用Sequence DetectorSystem software version2.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，CT值自動(dòng)轉(zhuǎn)化為RNA的倍數(shù)變化值，計(jì)算方式為（實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組）倍數(shù)變化=2-(ΔΔ CT)，where-(ΔΔCT)=-(ΔCTtrt-ΔCTcontrol)=-[(CtTarget-CtGAPDH) trt-(CtTarget-CtGAPDH) control].
　　4.β-半

5、乳糖苷酶染色:內(nèi)皮細(xì)胞被轉(zhuǎn)染不同濃度的KNDC1腺病毒后培養(yǎng)48小時(shí)，吸除細(xì)胞培養(yǎng)基，并以PBS沖洗細(xì)胞面兩遍，使用固定液室溫固定15 min。吸除細(xì)胞固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。加入染色工作液，37℃孵育24小時(shí)。普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照:胞漿呈藍(lán)色者為陽性細(xì)胞，表示細(xì)胞處于衰老狀態(tài)，計(jì)算出的陽性細(xì)胞總數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　5.Westemblot檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白:采用Westemblot法檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)

6、皮細(xì)胞KNDC1、SIRT1、p53、p-p53、Erk、p-Erk、p21、p27、eNOS蛋白的表達(dá)。
　　6.抗氧化酶活性檢測(cè):分光光度法檢測(cè)各組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)含量。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn);三組比較采用單因素方差分析比較，如差別存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SNK方法進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05，認(rèn)

7、為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.在本研究中，第六代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)呈現(xiàn)出有別于前期傳代細(xì)胞的衰老特征，細(xì)胞變得扁平，體積增大，增殖能力降低。為了進(jìn)一步研究KNDC1是否與細(xì)胞衰老有關(guān)，通過qPCR及western blot的方法，我們檢測(cè)了各代齡細(xì)胞間KNDC1轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)隨著臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，KNDC1轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)水平逐漸增加，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.使用攜帶KNDC1的腺病毒轉(zhuǎn)染

8、第六代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，KNDC1的表達(dá)水平顯著上升。KNDC1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加了239-344％，同樣的KNDC1蛋白質(zhì)表達(dá)也顯著增加，并且有明顯的劑量依賴性。
　　3.和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染KNDC1腺病毒后的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SA-β-Gal染色陽性率顯著上升。隨著KNDC1腺病毒轉(zhuǎn)染劑量從30到90 epu/cell，內(nèi)皮細(xì)胞SA-β-gal染色陽性率也大致呈劑量依賴性增加，各組間染色陽性率分別為6.2±1.3％(C)，8.

9、2±0.3％(A)，26.3±2.5％(K30)，62.9±2.8％(K60)和55.3±5.8％(K90)。K60和K90兩組染色陽性率無明顯差異，因此在以后的研究中實(shí)驗(yàn)組KNDC1腺病毒轉(zhuǎn)染量均為60 epu/cell。
　　4.為了探究KNDC1高表達(dá)是否影響內(nèi)皮細(xì)胞MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，我們檢測(cè)各組細(xì)胞間MAPK相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)磷酸化erk表達(dá)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.作為一種重要的細(xì)胞周期抑制因

10、子，實(shí)驗(yàn)組磷酸化p53較陰性對(duì)照組明顯增加(113.5±9.0 vs.244.3±19.5)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示p53信號(hào)通路在KNDC1相關(guān)性細(xì)胞衰老中發(fā)揮了重要作用。
　　6.本課題組既往研究表明KNDC1敲低可以通過減少細(xì)胞內(nèi)活性氧含量而延緩細(xì)胞衰老，在本研究中，我們確認(rèn)了這種變化，實(shí)驗(yàn)組抗氧化酶含量較對(duì)照組下降(SOD:98.0±3.0 vs.83.3±5.1 and Gpx:95.0±6.0 vs.83.0±5.6

11、)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建了攜帶KNDC1基因的重組腺病毒載體，并運(yùn)用重組腺病毒載體成功轉(zhuǎn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，且轉(zhuǎn)染率較高。
　　2.KNDC1腺病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞后β半乳糖苷酶染色陽性，證明KNDC1在內(nèi)皮細(xì)胞衰老途徑中發(fā)揮了重要作用。
　　3.KNDC1腺病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞后抗氧化酶表達(dá)降低，證實(shí)了氧化應(yīng)激與KNDC1相關(guān)性內(nèi)皮細(xì)胞衰老形成有著直接的聯(lián)系。
　　4.KNDC1可以激活p5