

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、實體的惡性腫瘤的生長和轉移依靠腫瘤新生血管的形成,抗腫瘤血管生成藥物早已運用到臨床治療方面??缒に募易宄蓡T1(Transmembrane4super family, TM4SF1)是TM4SF家族(Tetraspanins)的一個遠親,高表達于多種上皮性腫瘤中,在培養(yǎng)的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)中也高表達。TM4SF1與腫瘤血管的生成密切相關,并被證實其高表達與多種腫瘤細胞的遷移、侵襲、轉移及不良預后正相關。本課題組前期研究已從
2、用卵巢上皮癌患者腹水癌細胞構建的cDNA表達文庫中,篩選出相關抗原TM4SF1,發(fā)現血清中的TM4SF1自身抗體可作為卵巢上皮癌診斷的血清學指標,且下調TM4SF1的表達,可抑制卵巢上皮癌細胞株HO8910PM的增殖、遷移及轉移。本研究通過沉默TM4SF1基因在HUVEC的表達,研究TM4SF1對HUVEC增殖、遷移及血管生成的影響,并將沉默TM4SF1基因的人卵巢癌細胞HO8910PM與HUVEC共接種于裸鼠皮下,利用活體動物成像技術
3、,觀察沉默TM4SF1基因后對裸鼠皮下移植瘤的生長、轉移及腫瘤血管生成的影響。
本文主要從以下幾個部分展開論述:
第一部分 慢病毒介導TM4SF1基因沉默的HUVEC及HO8910PM穩(wěn)定株的構建
目的:利用RNA干擾技術,建立慢病毒介導TM4SF1基因穩(wěn)定沉默的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)株及人卵巢癌細胞(HO8910PM)株。
方法:設計并合成含靶向沉默TM4SF1并同時表達GFP或熒光
4、素酶基因的兩種慢病毒載體,并命名為LV-TM4SF1-RNAi-GFP及LV-TM4SF1-RNAi-Luc,將LV-TM4SF1-RNAi-GFP感染高表達TM4SF1的HUVEC,經流式細胞儀篩選出穩(wěn)定表達的GFP的細胞株LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC。將LV-TM4SF1-RNAi-Luc感染高表達TM4SF1的HO8910PM,用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達熒光素酶基因的LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO89
5、10PM。以陰性對照及空白對照為對照,通過RT-PCR及Westem blotting技術檢測兩種穩(wěn)定株中TM4SF1的基因及蛋白表達。
結果:成功構建了靶向沉默TM4SF1并同時表達GFP或熒光素酶基因的兩種慢病毒載體,感染并篩選出穩(wěn)定表達細胞株LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC及LV-TM4 SF1-RNAi-Luc/HO8910PM,與陰性對照LV-CON-RNAi-GFP/HUVEC(LV-CON-RNA
6、i--Luc/HO8910PM)組及HUVEC(HO8910PM)空白組相比,LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC及LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PM組TM4SF1 mRNA表達顯著下降,為[(0.06±0.02) vs(0.95±0.13)/(1.02±0.13),P<0.05]([(0.05±0.02) vs(0.91±0.13)/(1.04±0.13),P<0.05]);蛋白表達亦明顯降低[(0.1
7、3±0.01)vs(0.75±0.03)/(0.75±0.04),P<0.05](0.11±0.01)vs(0.58±0.02)/(0.65±0.03),P<0.05]),而陰性對照LV-CON-RNAi-GFP/HUVEC(LV-CON-RNAi--Luc/HO8910PM)組及HUVEC(HO8910PM)空白組差別無統(tǒng)計學意義,P均大于0.05。
結論:利用RNA干擾技術構建出穩(wěn)定沉默TM4SF1的LV-TM4SF1-R
8、NAi-GFP/HUVEC及LV-TM4 SF1-RNAi-Luc/HO8910PM細胞株。
第二部分 TM4SF1基因沉默對血管內皮細胞生物學行為影響的體外研究
目的:探討TM4SF1基因沉默對HUVEC的增殖、周期、遷移及血管生成的影響。
方法:實驗分3組:HUVEC空白組,LV-CON-RNAi--Luc/HO8910PM組及LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC組。應用CCK-8法檢測細胞
9、增殖能力的變化,FCM檢測細胞周期的變化,Transwell小室檢測細胞遷移能力的改變,基質膠成管實驗檢測細胞血管生成能力的改變。
結果:TM4SF1基因沉默后,HUVEC增殖活性受抑制[72h時OD值:(0.59±0.06) vs(0.98±0.04)/(1.05±0.05),P<0.05];細胞被阻滯在G0/G1期[(69.30±5.48) vs(54.44±4.09)/(51.69±4.16),P<0.05];遷移能力明
10、顯降低[(14.20±4.59) vs(70.60±17.75)/(74.40±16.06),P<0.05];管腔樣結構明顯減少[(3.33±1.52) vs(19.66±1.52)/(22.66±2.08),P<0.05]。而HUVEC空白組與LV-CON-RNAi--Luc/HO8910PM組差別無統(tǒng)計學意義。
結論:沉默TM4SF1基因使HUVEC的增殖、遷移及血管生成能力均受抑制。
第三部分 TM4SF1基因
11、沉默對卵巢癌腫瘤血管形成影響的體內研究
目的:構建適用于小動物活體成像系統(tǒng)觀察的裸鼠皮下移植瘤模型,探討TM4SF1基因沉默對卵巢癌腫瘤生長、轉移及血管生成的影響。
方法:用transwell小室共培養(yǎng)HO8910PM及HUVEC細胞,確定兩種細胞體外最適合生長比例。再按已確定的細胞比例將穩(wěn)定沉默TM4SF1的HUVEC及HO8910PM細胞株共接種于裸鼠皮下,構建適用于小動物活體成像系統(tǒng)觀察的裸鼠皮下移植瘤模型。將
12、36只雌性裸鼠隨機分為6組,分別為A: LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM; B: LV-TM4SF1-RNAi-Luc/ HO8910PM; C: LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM+LV-CON1-RNAi-GFP/ HUVEC; D: LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM+LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC,E:LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PM+LV-CO
13、N1-RNAi-GFP/HUVEC;F:LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PM+LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC。通過活體成像系統(tǒng)檢測腫瘤的生長、轉移,通過免疫組化染色技術觀察各組移植瘤中腫瘤血管形成的情況。
結果:transwell小室共培養(yǎng)HO8910PM及HUVEC細胞,確定兩種細胞體外最適合生長比例為HO8910PM/HUVEC:2/1。活體成像系統(tǒng)能夠檢測體外最小的生物素發(fā)光的腫瘤細胞
14、數為102個。36只裸鼠成瘤率100%,6周時共死亡4只。到第6周時,共接種HUVEC組(C、D、E、F)移植瘤體積明顯大于單接種HO8910PM組(A、B)。B組移植瘤體積明顯小于陰性對照組A[(0.11±0.05) vs(0.87±0.05),P<0.05];D、E、F組移植瘤體積也不同程度的小于陰性對照組C[(0.26±0.06)/(0.23±0.07)/(0.04±0.03)vs(0.72±0.08),P均<0.05],共接種組
15、中完全沉默組F移植瘤最小,部分沉默組D與E相當?;铙w成像系統(tǒng)下觀察移植瘤的動態(tài)生長情況,隨著時間的延長,生物發(fā)光熒光信號逐漸增強,但6組均未檢測到轉移瘤,解剖裸鼠未見腹腔各臟器種植及轉移瘤。采用RT-PCR及Western blotting方法驗證移植瘤TM4SF1的基因和蛋白沉默效果,沉默組明顯低于對照組,與體外細胞實驗一致。免疫組化染色技術觀察得出,共接種HO8910PM和HUVEC組(C、D、E、F)的微血管數明顯高于單接種HO8
16、910PM組(A、B),但僅在共接種組中見到人源化的微血管。單接種組中,對照組(6.67±1.53)與沉默組(6.33±0.57)微血管數差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。共接種組中人源化微血管數占總微血管數90%以上。從總微血管數來看,C組(60.67±5.77)和E組(60.33±9.07)微血管數明顯多于D組(36.35±6.42)和F組(31.56±6.11)(P均<0.05),而C組和E組、D組和F組之間微血管數無明顯差異(P
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 牙齦卟啉單胞菌對人臍靜脈血管內皮細胞的生物學效應.pdf
- 降鈣素基因相關肽(CGRP)對人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)的生物學效應及其機制研究.pdf
- 低氧對人微血管內皮細胞HIF-1α表達及生物學行為的影響.pdf
- 榅桲提取物抗人臍靜脈血管內皮細胞凋亡的初步研究.pdf
- 游離脂肪酸對人臍靜脈血管內皮細胞合成NO及ET的影響.pdf
- 尿酸與人臍靜脈血管內皮細胞功能的體外研究.pdf
- 伏馬菌素FB1對人臍靜脈血管內皮細胞的毒性作用研究.pdf
- 脂質體介導Survivin基因過表達對人臍靜脈內皮細胞生物學活性的影響.pdf
- 硫酸鎂對人臍靜脈血管內皮細胞放射損傷分子機制的研究.pdf
- 玉米赤霉烯酮對人臍靜脈血管內皮細胞的毒性作用研究.pdf
- 硫酸鎂防治人臍靜脈血管內皮細胞放射損傷機制的初步探索.pdf
- 缺氧預處理對人臍靜脈血管內皮細胞缺氧損傷保護作用的研究.pdf
- 降鈣素基因相關肽促進人臍靜脈血管內皮細胞增殖及其相關機制的初步研究.pdf
- KNDC1過表達對人臍靜脈血管內皮細胞衰老的作用及其機制研究.pdf
- 硫酸鎂對人臍靜脈血管內皮細胞放射損傷的防護作用.pdf
- 夏枯草、皂角刺抑制人臍靜脈血管內皮細胞增殖的實驗研究.pdf
- 雌激素對人臍靜脈血管內皮細胞內質網應激的凋亡影響.pdf
- 腫瘤壞死因子-α對人臍靜脈血管內皮細胞結構和功能的影響.pdf
- 人外周血內皮祖細胞與臍靜脈內皮細胞生物學特征的比較研究.pdf
- 微小RNA-429-455-3p通過VEGFR對血管內皮細胞生物學行為的影響.pdf
評論
0/150
提交評論