脂多糖體外誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡的研究.pdf

1、內毒素(endotoxin)為革蘭氏陰性菌(Gram’s negative，G)細胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)組分，是引起膿毒血癥(sepsis)和感染性休克(septic shock)的關鍵因素。內毒素激活多種細胞因子，產生級聯放大效應，損傷血管內皮細胞，最終導致多器官功能衰竭(multiple organ failure,MOF)。目前，大多數學者認為膿毒血癥并發(fā)多器官功能衰竭可能與血管內皮細胞凋亡、

2、宿主過度反應性及免疫網絡失控等因素有關，其中血管內皮細胞凋亡在膿毒血癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，但是確切的機理尚不清楚。 研究表明，血管內皮細胞覆蓋整個循環(huán)系統內表面，不僅起屏障作用，還有調節(jié)細胞代謝產物、調節(jié)血管舒張、止血和趨化白細胞的作用。血管內皮細胞生長、凋亡和生存的協調狀態(tài)，是保證正常血管功能和結構的重要基礎，是維持血管穩(wěn)態(tài)的決定性因素。血管內皮細胞是一種代謝活躍的細胞，體內外多種刺激因子均可作用于內皮細胞，從而誘發(fā)凋亡

3、。血管內皮細胞發(fā)生凋亡，會影響血管內皮細胞的再生，導致血管壁結構的破壞，還會影響血管內皮依賴性舒張功能，甚至還可影響到血管周圍的組織細胞，因此深入了解血管內皮細胞凋亡發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，對尋找保護內皮的措施有重要意義。 在感染性休克、多器官功能障礙綜合征時，如何及時保護血管內皮細胞，維持內皮細胞功能正常，將對保護心臟、肺、腦、肝臟等重要臟器功能有積極的作用。因此，本課題設計對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞施以不同濃度脂多糖處理后，檢測在

4、各時間點的細胞凋亡率，分析不同濃度脂多糖誘導內皮細胞凋亡的差異，為深入研究膿毒血癥的發(fā)病機理和抗細胞凋亡治療提供理論基礎。 實驗材料與方法： 一、實驗材料 1、實驗細胞 人臍靜脈內皮細胞ECV304細胞株 2、主要試劑及藥品 DMEM/F-12培養(yǎng)基、脂多糖、0.25％胰蛋白酶、10％胎牛血清、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、四甲基偶氮唑鹽、二甲基亞砜。 3、主

5、要儀器 超凈工作臺、細胞培養(yǎng)箱、低溫離心機、細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板、超低溫冰箱、倒置相差顯微鏡、全自動酶標儀、微孔濾器、流式細胞儀。 二、實驗方法： 1、細胞培養(yǎng) 細胞復蘇后，培養(yǎng)72小時，加入2/ml0.25％胰蛋白酶消化，2～3分鐘后吸出消化液棄掉，再加入含10％胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻細胞，按1：2傳代于細胞培養(yǎng)瓶中。于37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液一次，

6、3～4天傳代一次，待細胞生長至一定數量后，取培養(yǎng)24h的細胞用于實驗。 2、實驗分組 根據MTT實驗結果，將細胞分為4組：空白對照組、1組(脂多糖濃度為6.25ug/ml)、2組(脂多糖濃度12.5ug/ml)、3組(脂多糖濃度25ug/ml)及4組(脂多糖濃度50ug/ml)。每組3個標本，分別于4h、12h、24h及48h收集細胞，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。 3、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細

7、胞凋亡 按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，在流式細胞儀上每個標本計數1×104個細胞。 4、數據統計 采用SPSS11.0統計軟件進行統計學處理，運用重復測量資料的方差分析。實驗數據以均值±標準差表示，組間比較用多個樣本均數兩兩比較的SNK法，P<0.05有顯著性差異。 實驗結果： 一、脂多糖對血管內皮細胞的形態(tài)學影響在倒置相差顯微鏡下觀察正常對照組培養(yǎng)24h的

8、人臍靜脈內皮細胞，大部分細胞貼壁，細胞呈梭性或不規(guī)則三角形，核清晰，有些細胞魚貫狀相連；而脂多糖處理組細胞形態(tài)有明顯受損的改變，胞體變圓、邊緣不清、受損細胞發(fā)生皺縮，近似細胞凋亡表現。 二、MTT實驗測定細胞生長抑制率 人臍靜脈內皮細胞被脂多糖干預后，細胞生長受到抑制，脂多糖的濃度與細胞生長抑制率成正比，從脂多糖濃度為3.125 ug/ml時的20.16％，到脂多糖濃度200 ug/ml時的91.68％。其中，細胞生長抑

9、制率變化明顯、并且吸光度值有顯著差異的脂多糖濃度為6.25 ug/ml～50 ug/ml(P<0.05)，因此接下來的實驗選擇6.25ug/ml、12.5ug/ml、25 ug/ml及50 ug/ml脂多糖濃度分組。 三、流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡 不同濃度脂多糖組在4h、12h、24h及48h的細胞凋亡率與對照組比較都有顯著差異(P<0.05)，即脂多糖能夠誘導內皮細胞凋亡；而各脂多糖濃度組之

10、間比較，除在4h時無顯著差異(P>0.05)外，在12h、24h及48h都有顯著差異，即在12h、24h及48h 3個時間點脂多糖濃度增大，內皮細胞凋亡率隨之增加； 同一濃度脂多糖組在4h、12h及24h時的細胞凋亡率有顯著差異(P<0.05)，但是與48h比較無統計學意義，即在4h～24h之間，一定濃度的脂多糖作用于內皮細胞，隨時間延長，細胞凋亡率增加。 結論： 1、脂多糖能夠在體外抑制人臍靜脈內皮細胞生長。