EGFR家族中等親和力嵌合抗原受體修飾T細胞的廣譜抗腫瘤效能.pdf

1、嵌合抗原受體(CAR)修飾的T細胞(CART)和T細胞受體(TCR)修飾的T細胞免疫治療是新型快速發(fā)展的免疫治療策略。CAR賦予了T細胞抗原特異性的識別，激活和增殖，依賴于主要組織相容性復合物非依賴的途徑。CAR目前發(fā)展為第三代，包含兩個共刺激分子，CD28+CD134(OX40)或CD28+CD137(4-1BB)，第三代CAR相比于第二代CAR，細胞因子分泌和裂解作用均增強，激活誘導的細胞死亡率降低。
　　2012年，Klos

2、s CC研究小組在《Nature Biotechnology》上發(fā)表的關于調(diào)整親和力后雙載體系統(tǒng)(CAR+CCR)的殺傷特異性及效能，該研究在提高雙CAR系統(tǒng)的特異性的同時，也開啟了調(diào)控CAR載體對抗原親和力的新的優(yōu)化方向。2015年9月《Cancer Research》上發(fā)表的兩篇調(diào)整CAR載體對抗原的親和力降低脫靶效應的研究，研究表明高親和力的CAR-T細胞對EGFR抗原低水平的和高水平表達的腫瘤細胞均有較強的殺傷效能，而低親和力的

3、CAR-T細胞只殺傷EGFR高表達的腫瘤細胞，且殺傷效能與EGFR的表達量呈正相關，因此，本課題我們選取中等親和力的CAR-T細胞進行研究，在殺傷腫瘤細胞的同時降低脫靶效應。
　　調(diào)整CAR-T細胞的親和力使其特異性殺傷腫瘤細胞，豁免低水平表達靶抗原的正常細胞，降低脫靶效應。但由于腫瘤組織的異質(zhì)性，即腫瘤組織由于特殊的組織病理學的差異，靶抗原的表達量也會有所差異，降低CAR載體的親和力，也會引起靶抗原低水平表達的腫瘤細胞逃逸，豁免

4、正常細胞的同時也會降低療效。因此，降低親和力，靶向單個抗原分子的CAR-T細胞無法徹底消除所有的腫瘤細胞。
　　EGFR家族EGFR(HERl/erbB-1),HER2(ErbB-2 or neu),HER-3(erbB-3)andHER-4(erbB-4)在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、頭頸部的癌癥等多種腫瘤細胞中過表達，且家族成員在各種惡性腫瘤組織中的總陽性比例接近100％?；谏厦娴膬蓚€原因，我們構(gòu)建了能同時靶向EGFR家

5、族的中等親和力G3Herin-CAR-T細胞，猜想并證明其靶向識別并殺傷多種惡性腫瘤細胞，且中等親和力可以降低脫靶效應引起對正常組織的殺傷作用。
　　第一部分 靶向EGFR家族嵌合抗原受體的構(gòu)建
　　選取靶向EGFR家族的中等親和力HERIN片段并構(gòu)建第三代CAR載體G3Herin-CAR，通過酶切鑒定及基因測序，證明我們成功構(gòu)建了G3Herin-CAR載體。
　　第二部分 靶向EGFR家族嵌合抗原受體對T細胞株的遺傳

6、修飾
　　采用電穿孔技術把G3Herin-CAR載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入健康志愿者的外周血PBMC中，用2％AIM+IL-2對T細胞進行共培養(yǎng)。通過蛋白免疫印跡分析，流式細胞術(FCM)檢測CAR-T轉(zhuǎn)染的陽性率和激活表型的表達，驗證通過電轉(zhuǎn)染技術成功對T細胞株進行遺傳修飾，并在T細胞內(nèi)表達G3Herin-CAR目的基因。
　　第三部分 靶向EGFR家族嵌合抗原受體修飾T細胞的體外效能檢測
　　本部分實驗，采用蛋白免疫印跡分析、流

7、式細胞術檢測EGFR家族蛋白的表達篩選合適的腫瘤細胞，用Recombinant human EGFR抗原刺激G3Herin-CAR-T細胞，流式細胞術檢測細胞因子IFN-r，TNF-a的分泌量，利用xCELLigence RTCA DP儀器實時檢測CAR-T細胞對多種腫瘤細胞的殺傷效果，評估G3Herin-CAR-T細胞的體外細胞毒性效能。
　　實驗結(jié)果證明了最初的設計:靶向EGFR家族的中等親和力pNBS328-G3Herin-