hTERT廣譜抗腫瘤基因疫苗實驗研究.pdf

1、背景與目的：
　　 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reversetranscrip tase，hTERT）是端粒酶復(fù)合物的核心成分，其表達(dá)狀態(tài)是細(xì)胞調(diào)控端粒酶活性的重要環(huán)節(jié)。hTERT是最早發(fā)現(xiàn)，也是目前研究較多的廣譜腫瘤相關(guān)抗原（TAA）之一.已經(jīng)證實在85％以上的人類惡性腫瘤細(xì)胞中均存在hTERT的再激活，并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。hTERT的廣泛表達(dá)使其成為腫瘤治療的理想靶點.本研究通過

2、特異性擴增hTERT基因，成功構(gòu)建了hTERT新型基因疫苗，并且建立了穩(wěn)定表達(dá)hTERT的B16細(xì)胞系。為進(jìn)一步研究hTERT基因疫苗在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 通過RT-PCR的方法從人前列腺癌細(xì)胞系PC-3M中特異性擴增hTERT基因，連接到真核表達(dá)載體pIRES-neo中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-neo-hTERT.脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞，通過G418加壓篩選單克隆細(xì)胞系，用

3、western blot及免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測B16細(xì)胞中hTERT基因的蛋白表達(dá)。
　　 擴增出hTERT基因片段eTERT（1609bp-2628bp），連接到真核表達(dá)載體pVAX1-IRES中，構(gòu)建hTERT廣譜抗腫瘤基因疫苗pVAX1-eTERTFcGB，脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測其表達(dá)情況.
　　 結(jié)果：
　　 特異性擴增得到大小與人hTERT基因相符的基因片段，

4、序列測定證實與GenBank上登錄的序列一致；成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-neo-hTERT.質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞，經(jīng)加壓篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)hTERT的B16細(xì)胞系。
　　 成功擴增出hTERT基因片段eTERT（1609bp-2628bp），并構(gòu)建hTERT廣譜抗腫瘤基因疫苗pVAX1-eTERTFcGB，流式細(xì)胞儀和免疫熒光的檢測結(jié)果顯示，重組基因疫苗質(zhì)粒pVAX1-eTERTFcGB在293T細(xì)胞中得到很好的表達(dá)。<