靶向CD19的嵌合抗原受體修飾的T細胞(CD19-CAR-T)構(gòu)建及其對CD19陽性血液腫瘤細胞的殺傷研究.pdf

1、研究目的：
　　隨著基因編輯技術(shù)的逐步發(fā)展，過繼性免疫治療(Adoptive cellular therapy，ACT)在腫瘤生物治療中占據(jù)著越來越重要的作用。由于諸多限制，以往的過繼免疫治療并未產(chǎn)生持續(xù)、明顯的抗瘤作用。但是一種新的過繼性免疫療法--嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)的發(fā)展極大的增強了過繼性免疫治療的治療效果，其突出優(yōu)點是可以克服MHC限制性。
　　CD19抗原特異性

2、表達于B淋巴細胞及B系血液腫瘤細胞表面，在正常的造血干細胞表面不表達，是CAR-T治療B系血液腫瘤的研究熱點。本課題以pcDNA?3.1(+)為質(zhì)粒載體，使用小鼠抗人CD19單抗（克隆號：FMC63）為胞外單克隆抗體單鏈可變區(qū)序列，以CD137為共刺激分子，T細胞受體(TCR)/ CD3的-δ鏈作為胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域來構(gòu)建第二代嵌合抗原受體。同時采用不同培養(yǎng)方法來培養(yǎng)構(gòu)建的CAR-T細胞，觀察不同培養(yǎng)條件下的構(gòu)建CAR-T表達效率，然后使用

3、培養(yǎng)的CD19-CAR-T細胞殺傷CD19陽性血液腫瘤細胞及對照細胞，觀察殺傷性細胞因子的分泌及其靶向性殺傷作用，對CAR-T細胞在體內(nèi)外抗CD19陽性血液腫瘤的作用進行初步研究。
　　研究方法：
　　確定CD19單抗的單鏈可變區(qū)片段、CD137共刺激分子及CD3-δ鏈序列，使用基因工程方法將其整合成一個整體序列，即CD19-CAR。然后將CD19-CAR片段克隆到慢病毒載體pcDNA?3.1(+)上，選用的插入酶切位點是N

4、heI/BamHI。然后將穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)和pcDNA?3.1(+)目的質(zhì)粒共培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染293T細胞，制備成慢病毒，使用DNA測序及流式檢測構(gòu)建慢病毒序列是否正確。進而使用慢病毒對活化T細胞進行感染，使用加有IL-15或不加IL-15的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CD19-CAR-T細胞，利用流式細胞術(shù)檢測CD19-CAR-T細胞的生長表達情況、細胞內(nèi)細胞因子的表達。
　　結(jié)果：
　　DNA

5、測序表明慢病毒基因序列構(gòu)建正確，通過熒光顯微鏡及稀釋倍數(shù)測定制備的慢病毒滴度約為2×108TU/ml。轉(zhuǎn)染慢病毒后（本身表達EGFP）的T細胞加Fc-APC抗體檢測，EGFP熒光/ Fc-APC雙陽性，流式結(jié)果表明CD19-CAR-構(gòu)建成功可以在細胞膜表面表達。加入低濃度的IL-15的CAR-T表達率為45％，未加入IL-15的CAR-T表達率為9%。CD19-CAR-T細胞與293T細胞共培養(yǎng)后IL-2、TNF-α殺傷細胞因子分泌量分