抗CD19嵌合性抗原受體的構(gòu)建、優(yōu)化及其體外功能評價.pdf

1、過繼性細(xì)胞免疫治療（adoptive cell immunotherapy, ACI）是目前公認(rèn)的治療惡性腫瘤較為有效的方法之一。隨著過繼性細(xì)胞免疫治療技術(shù)的日趨發(fā)展、成熟和完善，該療法已在多種惡性腫瘤的臨床治療中取得較好療效。
　　基因工程化 T細(xì)胞過繼性細(xì)胞療法是過繼性細(xì)胞免疫療法的一種，這種療法是將病人外周血中的T淋巴細(xì)胞通過基因工程改造，使其表達(dá)一個基因改造的T細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR）或者表達(dá)一

2、個嵌合性抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR）來靶向已知的腫瘤抗原。其中基因工程化嵌合性抗原受體 T細(xì)胞的臨床應(yīng)用前景非常廣闊。
　　嵌合性抗原受體（CAR）主要由三部分組成：胞膜外抗原結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和胞膜內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。胞膜外抗原結(jié)合區(qū)通常是一段單鏈抗體（single chain antibody fragment, scFv），具有抗原特異性，能夠識別并結(jié)合腫瘤特異性抗原。跨膜區(qū)通常是由免疫球蛋

3、白超家族組成，如CD8和CD28等。胞膜內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)是由CD3的ζ鏈組成。
　　CAR T細(xì)胞能夠直接識別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)抗原，使T細(xì)胞激活并分泌多種細(xì)胞因子，如穿孔素、顆粒酶、γ干擾素（Interferon-γ, IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）等，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。因此，CAR T細(xì)胞沒有主要組織相容性復(fù)合體（major histocompa

4、tibility complex, MHC）的限制性，并且CAR T技術(shù)使得效應(yīng)T細(xì)胞的靶向性、增殖活性和持久性得到增強，在一定程度上打破腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和宿主免疫耐受狀態(tài)。
　　CAR T細(xì)胞已經(jīng)在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的臨床治療中獲得成功，如急性淋巴細(xì)胞白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病。但CAR T細(xì)胞在實體瘤治療中療效有限，并且該技術(shù)還存在脫靶效應(yīng)、插入突變、引起“細(xì)胞因子風(fēng)暴”等臨床應(yīng)用風(fēng)險。
　　RNA結(jié)合蛋白QKI是S

5、TAR家族成員之一，可以編碼多種蛋白。以往的研究表明QKI參與血管和神經(jīng)的分化、發(fā)育。我們實驗室的研究表明，QKI可能參與了T細(xì)胞的分化過程，提示QKI可能在CAR T細(xì)胞的治療中發(fā)揮重要作用。
　　本研究旨在構(gòu)建靶向 CD19的第三代嵌合性抗原受體，在體外建立穩(wěn)定表達(dá)抗CD19嵌合性抗原受體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并評價其活化效應(yīng)，然后干涉 QKI的表達(dá)，檢測抗 CD19嵌合性抗原受體的體外活化效應(yīng)變化。最后在人源外周血單個核細(xì)胞（per

6、ipheral blood mononuclear cell, PBMC）中表達(dá)抗CD19嵌合性抗原受體，評價其體外活化效應(yīng)和殺傷效應(yīng)，為將來進(jìn)一步優(yōu)化CAR T細(xì)胞的靶向策略打下基礎(chǔ)。
　　【目的】
　　1)構(gòu)建靶向CD19嵌合性抗原受體的表達(dá)載體。
　　2)利用Jurkat細(xì)胞系，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)抗CD19嵌合性抗原受體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并檢測其體外活化效應(yīng)。然后在穩(wěn)轉(zhuǎn)Jurkat細(xì)胞系中干涉QKI的表達(dá)，檢測其體外活化效

7、應(yīng)的變化，驗證QKI對CAR T細(xì)胞的影響。
　　3)分離人源PBMC，并在PBMC中穩(wěn)定表達(dá)抗CD19嵌合性抗原受體，驗證抗CD19嵌合性抗原受體的體外活化效應(yīng)，并檢測其體外殺傷效應(yīng)。
　　【方法】
　　1)獲取CAR片段，轉(zhuǎn)入pCMV6-Entry質(zhì)粒，構(gòu)建pCMV6-Entry-CAR表達(dá)載體。通過重組酶的作用將pCMV6-Entry-CAR載體和pLenti6.3/V5-DEST質(zhì)粒進(jìn)行重組，構(gòu)建pLenti6

8、.3/V5-DEST-CAR表達(dá)載體。
　　2)包裝慢病毒并感染Jurkat細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)CAR的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，將穩(wěn)轉(zhuǎn)Jurkat細(xì)胞和 Raji細(xì)胞共孵育后，利用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測孵育上清中白細(xì)胞介素2（interleukin-2, IL-2）的濃度，判斷抗CD19嵌合性抗原受體的體外活化效應(yīng)。然后在穩(wěn)轉(zhuǎn)Jurkat細(xì)胞系中干涉QKI的表

9、達(dá)，和Raji細(xì)胞共孵育后，利用ELISA檢測孵育上清中IL-2的濃度，驗證QKI的表達(dá)下調(diào)后對其體外活化效應(yīng)的影響。
　　3)分離人源PBMC，并在PBMC中穩(wěn)定表達(dá)抗CD19嵌合性抗原受體，然后與Raji細(xì)胞共孵育，利用ELISA檢測孵育上清中IL-2的濃度，驗證其體外活化效應(yīng)。并且利用乳酸脫氫酶試劑盒檢測孵育上清中乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase, LDH）的濃度，判斷抗CD19嵌合性抗原受體的體外殺傷效

10、應(yīng)。
　　【結(jié)果】
　　1)成功構(gòu)建了pLenti6.3/V5-DEST-CAR表達(dá)載體。
　　2)篩選感染后的Jurkat細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)抗CD19嵌合性抗原受體，與Raji細(xì)胞共孵育后細(xì)胞上清中IL-2的濃度為22 pg/ml，表明我們所構(gòu)建的CAR T細(xì)胞具有良好的活化效應(yīng)。干涉QKI的表達(dá)后，與Raji細(xì)胞共孵育后細(xì)胞上清中IL-2的濃度增加至28.5 pg/ml，說明QKI低表達(dá)能夠進(jìn)一步促進(jìn)CAR T細(xì)胞的活

11、化效應(yīng)。
　　3)分離人源PBMC，并在PBMC中穩(wěn)定表達(dá)抗CD19嵌合性抗原受體，與Raji細(xì)胞共孵育后檢測細(xì)胞上清中IL-2的濃度為1757 pg/ml，進(jìn)一步驗證了我們所構(gòu)建的CAR T細(xì)胞的體外活化效應(yīng)。與Raji細(xì)胞共孵育后檢測細(xì)胞上清中LDH的濃度，根據(jù)吸光度值計算得出Raji細(xì)胞的死亡率為15.3％，充分說明我們所構(gòu)建的CAR T細(xì)胞具有良好的體外殺傷效應(yīng)。
　　【結(jié)論】
　　通過本課題的研究，在 Jur

12、kat細(xì)胞中我們利用 pLenti6.3/V5-DEST-CAR表達(dá)載體，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)抗 CD19嵌合性抗原受體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并證實了其具有良好的體外活化效應(yīng)。在穩(wěn)轉(zhuǎn)Jurkat細(xì)胞系中進(jìn)一步干涉QKI的表達(dá)，穩(wěn)轉(zhuǎn)Jurkat細(xì)胞的體外活化效應(yīng)進(jìn)一步增強，說明QKI在CAR T細(xì)胞的活化效應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，為進(jìn)一步明確和構(gòu)建CAR T細(xì)胞提供新的研究視野。通過在人源PBMC細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)抗 CD19嵌合性抗原受體，同樣證明了其具有