靶向c-Met嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備及對(duì)鼻咽癌細(xì)胞作用的研究.pdf

1、研究背景:鼻咽癌(NPC)是我國(guó)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一，主要發(fā)病于我國(guó)的南方地區(qū)。但是由于其解剖位置較深和早期癥狀不典型，約80％的鼻咽癌患者在第一次就診時(shí)就已經(jīng)發(fā)展到晚期。放療聯(lián)合以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的化療為局部晚期鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，雖然局部和區(qū)域控制率有所改善，超過(guò)30％的患者仍然發(fā)生復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。面臨這些挑戰(zhàn)，迫切需要發(fā)展新的治療策略，以提高局部晚期鼻咽癌患者的生存率。
　　最新研究結(jié)果表明，鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與原癌基

2、因編碼的產(chǎn)物c-Met密切相關(guān)。c-Met蛋白屬于肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體家族，c-Met通過(guò)與配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)結(jié)合，激活HGF/c-Met信號(hào)通路，降低細(xì)胞間的粘附力，有利于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，c-Met可以成為鼻咽癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)。
　　嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞是一種將抗體靶向治療和T細(xì)胞免疫治療相結(jié)合的治療方法。通過(guò)識(shí)別腫瘤表面抗原，帶領(lǐng)T細(xì)胞到達(dá)腫瘤周?chē)l(fā)揮T細(xì)胞的免疫功能，實(shí)現(xiàn)識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。

3、是一種很有發(fā)展空間的治療腫瘤的策略。
　　本研究擬在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)制備好的抗c-Met Fab抗體的基礎(chǔ)上，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建靶向c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞，制備c-MetCAR-T，觀(guān)察其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為鼻咽癌治療提供新發(fā)法、新思路。
　　研究目的:
　　1.構(gòu)建靶向c-Met的嵌合抗原受體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
　　2.制備抗c-Met CAR-T;觀(guān)察c-Met CAR-T對(duì)于

4、c-Met陽(yáng)性鼻咽癌細(xì)胞的增殖抑制作用;檢測(cè)c-Met CAR-T與c-Met陽(yáng)性的鼻咽癌共培養(yǎng)后細(xì)胞因子IFN-γ、 IL-2的變化。
　　研究方法:
　　1.利用基因工程技術(shù)構(gòu)建抗c-Met scFv，并將其重組到含有人IgG分子的CH2CH3以及CD28，CD137，CD3ζ等的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，形成c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，經(jīng)過(guò)測(cè)序檢測(cè)確認(rèn)。
　　2.c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的感染293T細(xì)胞，

5、通過(guò)Western blotting檢測(cè)c-Met CAR在293T細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝后感染T淋巴細(xì)胞，通過(guò)Western blotting檢測(cè)c-Met CAR在T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)。
　　4.通過(guò)流式、RT-PCR、Western Blotting方法篩選出表達(dá)c-Met的鼻咽癌細(xì)胞株，以及不表達(dá)c-Met的腫瘤細(xì)胞株。
　　5.通過(guò)CCK-8法檢測(cè)c-Met CAR-T細(xì)胞和

6、對(duì)照組CD19 CAR-T、未轉(zhuǎn)染T細(xì)胞與鼻咽癌細(xì)胞株CNE2、HONE1共培養(yǎng)4h、12h、24h后，對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株的增殖抑制作用。
　　6.c-MetCAR-T與鼻咽癌細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，通過(guò)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.經(jīng)PCR擴(kuò)增、優(yōu)化、酶切，連接等方法構(gòu)建c-Met CAR逆病毒載體，經(jīng)測(cè)序檢測(cè)序列正確。
　　2.c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染293

7、T細(xì)胞，裂解蛋白，Western Blotting檢測(cè)到抗人CD3ζ抗體的表達(dá)，與預(yù)期大小一致。結(jié)果說(shuō)明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在293T細(xì)胞中表達(dá)，293T細(xì)胞能夠用于病毒包裝。
　　3.c-Met CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒感染T淋巴細(xì)胞，裂解蛋白，Western Blotting檢測(cè)到抗人內(nèi)源性、外源性人CD3ζ抗體的表達(dá)分別為22KD、76KD，與預(yù)期大小一致。結(jié)果說(shuō)明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在T淋巴細(xì)胞中表達(dá)，成功制備c-MetCAR-T

8、。
　　4.通過(guò)流式、RT-PCR、Western Blotting成功篩選出表達(dá)c-Met的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2和HONE1，以及不表達(dá)c-Met的對(duì)照組卵巢癌細(xì)胞株HO8910。
　　5.CCK-8結(jié)果顯示c-Met CAR-T與鼻咽癌細(xì)胞分別共培養(yǎng)4h、12h、24h，4h時(shí)殺傷率最高。隨著T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞比例的增加，對(duì)于腫瘤細(xì)胞的抑制作用就越明顯。當(dāng)比例為20∶1時(shí)，殺傷率最高，c-Met CAR-T細(xì)胞對(duì)鼻咽癌細(xì)胞

9、株CNE2、HONE1的殺傷率分別為60.33±3.73％、61.33±4.73％。而對(duì)于對(duì)照組CD19CAR-T組和未轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞組(UTD)對(duì)HONE1、CNE2的殺傷率僅僅分別為27.67±0.94％、26.67±0.47％，30.67±1.70％、28.13±0.50％。相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.ELISA結(jié)果顯示c-Met CAR-T與c-Met陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞株共培養(yǎng)后分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2明顯增加;而