靶向EGFRvIII嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞抗腫瘤試驗(yàn)研究.pdf

1、背景：嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR）修飾T細(xì)胞作為一種新興的腫瘤過繼免疫治療（adoptive immunotherapy，AIT）新策略，近年來得到了快速發(fā)展，其能夠重塑T細(xì)胞的靶向性、增殖性及持久性，攻克腫瘤病灶的免疫抑制微環(huán)境，破壞宿主免疫耐受狀態(tài)，從而顯著增強(qiáng)其特異性腫瘤殺傷作用。表皮生長因子受體III型突變體（epidermal growth factor receper vari

2、ant III，EGFRvIII），與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)，在正常組織不表達(dá)，卻在惡性腫瘤如腦膠質(zhì)瘤等細(xì)胞表面特異性表達(dá)，從而成為靶向腫瘤治療的完美靶點(diǎn)。本研究以磷酸鈣沉淀法包裝制備、蔗糖超速離心法濃縮LV-EGFRvIII/3G-CAR，感染采集自健康成人新鮮外周靜脈血的、Dynabeads-CD3 Beads分離的及Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28激活擴(kuò)增的CD3+T細(xì)胞，通過共培養(yǎng)EGF

3、RvIII/3G-CAR+CD3+T細(xì)胞、EGFRvIII+U87細(xì)胞，驗(yàn)證EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T細(xì)胞選擇性殺傷作用，為惡性腫瘤如腦膠質(zhì)瘤等探索新的靶向治療策略。
　　目的：LV-EGFRvIII/3G-CAR感染體外分離、激活、擴(kuò)增后的健康成人新鮮外周靜脈血CD3+T細(xì)胞，共培養(yǎng)EGFRvIII+U87細(xì)胞、EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T細(xì)胞，檢驗(yàn)EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T細(xì)胞對E

4、GFRvIII+U87細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)。
　　方法：⑴磷酸鈣沉淀法把pCDH-EGFRvIII/3G-CAR載體質(zhì)粒、pVSVG包膜蛋白質(zhì)粒及pDel8.9包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝制備慢病毒LV-EGFRvIII/3G-CAR，蔗糖超速離心法濃縮LV-EGFRvIII/3G-CAR，有限稀釋法測定LV-EGFRvIII/3G-CAR滴度。⑵Dynabeads? CD3 Beads分離健康人外周血CD3+T細(xì)胞，Dynab

5、eads Human T-Activator CD3/CD28激活、擴(kuò)增CD3+T細(xì)胞，LV-EGFRvIII/3G-CAR感染CD3+T細(xì)胞。⑶FASC法檢測CD3+T細(xì)胞表面EGFRvIII/3G-CAR的表達(dá)水平，Western blot檢測CD3+T細(xì)胞中EGFRvIII/3G-CAR的表達(dá)水平。⑷ELISA法檢測EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T細(xì)胞中細(xì)胞因子IFN-γ的分泌水平，51Cr釋放法檢測EGFRvIII/3

6、G-CAR+CD3+T細(xì)胞對EGFRvIII+U87細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)。
　　結(jié)果：①慢病毒LV-EGFRvIII/3G-CAR滴度高達(dá)1.2x108TU/ml，CD3+T細(xì)胞的LV-EGFRvIII/3G-CAR感染率達(dá)73.65％，LV-EGFRvIII/3G-CAR成功轉(zhuǎn)入CD3+T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯。②EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T細(xì)胞、EGFRvIII+U87細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，檢測到明顯的IFN-γ細(xì)胞因子釋

7、放，高達(dá)(1902.7±96.23)pg/ml，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）；EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T細(xì)胞能夠特異性殺傷EGFRvIII+U87細(xì)胞，殺傷作用與E/T值呈正比關(guān)系；且在相同E/T值時(shí)，與GFP+T細(xì)胞、EGFRvIII/3G-CAR-T細(xì)胞相比， EGFRvIII/3G-CAR+CD3+T細(xì)胞對EGFRvIII+U87細(xì)胞的殺傷作用存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F值前者為2273.9，后者為2232.1，P﹤0.0