TAM信號(hào)通路在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者中的表達(dá)水平及其對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary Biliary Cirrhosis，PBC)是機(jī)體一類(lèi)重要的器官特異性的自身免疫性疾病，其主要病理特征為肝臟門(mén)管區(qū)小葉間膽管上皮細(xì)胞發(fā)生變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)引起的肝內(nèi)小膽管進(jìn)行性破壞伴門(mén)脈炎癥性改變，最終導(dǎo)致膽汁淤積，隨著病程進(jìn)展，肝臟發(fā)生纖維化，最終演變成肝硬化，肝癌甚至肝衰竭
　　而對(duì)于PBC具體的發(fā)病機(jī)制，當(dāng)前還不是十分清楚，已知突變的易感基因主要集中于多條免疫信號(hào)通路，這些信號(hào)通路與

2、免疫細(xì)胞功能密切相關(guān)如骨髓細(xì)胞分化、抗原遞程、T細(xì)胞分化、B細(xì)胞抗體分泌及NK細(xì)胞促炎因子的產(chǎn)生等;膽管上皮細(xì)胞是PBC肝臟病變的重要靶細(xì)胞，膽管上皮細(xì)胞損傷是PBC發(fā)病機(jī)制中重要的一環(huán);研究認(rèn)為膽管上皮細(xì)胞表達(dá)的T細(xì)胞配體是引起膽管上皮細(xì)胞損傷的重要原因，而膽管上皮細(xì)胞凋亡新生抗原也被證實(shí)與PBC膽管特異性損傷密切相關(guān);此外，膽管上皮細(xì)胞還可以行使抗原遞程細(xì)胞的功能，進(jìn)一步放大自身炎癥免疫損傷。
　　我們應(yīng)以動(dòng)態(tài)地眼光來(lái)探討PB

3、C特定階段的發(fā)病機(jī)制，探尋不同病理階段潛在的治療靶點(diǎn)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)PBC更加針對(duì)、更加有效地治療。
　　基于TAM信號(hào)通路、巨噬細(xì)胞極化與PBC的潛在聯(lián)系，我們擬通過(guò)本研究探討二者在PBC中的作用;主要擬解決以下幾個(gè)問(wèn)題:第一，探討TAM受體與配體在包括PBC在內(nèi)的相關(guān)自身免疫性疾病的mRNA表達(dá)水平;第二，分析游離的TAM受體家族分子在PBC患者中水平及其臨床意義;第三，探討PBC患者巨噬細(xì)胞極化水平的變化以及與Mer受體表達(dá)水平

4、的相關(guān)性;第四，初步探討Mer受體在PBC中調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的潛在生物學(xué)機(jī)制。
　　第一部分 TAM受體家族在自身免疫性疾病中的mRNA表達(dá)水平及其臨床意義
　　在本部分研究中，我們納入了原發(fā)性膽汁性肝硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性干燥綜合癥以及健康對(duì)照者，使用RT-PCR方法對(duì)比分析上述幾類(lèi)自身免疫性疾病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TAM受體及其配體的mRNA表達(dá)水平并分析其表達(dá)水平與患者的臨床特征間的相關(guān)性;結(jié)果

5、顯示TAM受體家族分子無(wú)論受體還是配體在自身免疫性疾病的外周血單個(gè)核細(xì)胞中均存在不同程度的異常表達(dá)，在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中Gas6與Tyro-3、Axl呈現(xiàn)顯著的低表達(dá)水平，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中Gas6、ProteinS、Ax1顯著低表達(dá)且這種低表達(dá)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的疾病嚴(yán)重程度及炎癥反應(yīng)水平密切相關(guān);而在PBC患者中，ProS與Ax1的表達(dá)水平顯著地降低，但與PBC患者的臨床特征無(wú)顯著相關(guān)性;該部分研究結(jié)果說(shuō)明在自身免疫性疾病中

6、TAM受體家族存在不同程度地低表達(dá)水平，基于TAM受體信號(hào)通路的功能進(jìn)一步反映該信號(hào)通路在自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中潛在的作用。
　　第二部分 原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清游離TAM受體家族分子水平及其臨床意義;
　　本部分研究中，我們檢測(cè)了原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清中游離TAM受體家族分子(sTAM)的濃度水平，發(fā)現(xiàn)PBC患者血清中ProS濃度顯著降低(102.1±10.0ug/ml vs108.6±5.6ug/ml，p＜0.

7、01)，而sMer、sTyro-3的濃度水平在PBC患者血清中顯著的高于健康對(duì)照者(21.1±7.5ug/ml vs17.1±2.65ug/ml;8.51±4.0ug/mlvs5.18±1.74ug/ml)，臨床相關(guān)性分析結(jié)果顯示:sMer水平與PBC患者的AKP、GGT、TBA水平呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性(r=0.33，p＜0.01;r=0.65，p＜0.01;r=.73，p＜0.01)，同樣，sTyro-3的濃度水平與AKP、GGT、TB

8、A呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性(r=0.48，p＜0.01;r=0.49，p＜0.01;r=.49，p＜.01)，進(jìn)而說(shuō)明在肝功能較差的PBC患者中游離的sMer、sTyro3水平要顯著增加;隨后的診斷試驗(yàn)顯示sTyro-3在PBC中的診斷ROC曲線下面積達(dá)到0.77(95％cCI0.69-0.85)，敏感度達(dá)0.70，特異度為0.78，其中Cutoff值為6.30ug/ml; sMer的ROC曲線下面積為0.66(95％CI0.56-0.76)

9、，敏感度達(dá)0.63，特異度為0.72，其中Cutoff值為17.7ug/ml;ProS的ROC曲線下面積為0.68(95％CI0.59-0.78)，敏感度達(dá)0.87，特異度為0.47，其中Cutoff值為103.1ug/ml;由此可見(jiàn)，血清中游離地TAM受體家族分子在PBC的診斷中具有重要地臨床意義。
　　第三部分 原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血單核巨噬細(xì)胞中TAM膜受體表達(dá)水平、巨噬細(xì)胞極化情況及二者之間的相關(guān)性;
　　在本

10、部分研究中，我們主要分析了原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血單核巨噬細(xì)胞極化情況，流式結(jié)果顯示在早期PBC患者中M1型巨噬細(xì)胞(CD68+/CCR2+)的比例要顯著高于晚期PBC患者(p＜0.05); M2型巨噬細(xì)胞(CD163+/CX3 CR1+)在晚期PBC患者外周血中比例要顯著高于早期PBC患者(p＜0.05);由于不同極化類(lèi)型的巨噬細(xì)胞分泌特異性細(xì)胞因子，為了進(jìn)一步驗(yàn)證PBC患者外周血M1與M2型巨噬細(xì)胞分布情況，我們檢測(cè)了TNF-α

11、、IL-12、TGF-β、IL-10的濃度水平;結(jié)果顯示在早期PBC患者中IL-12水平顯著高于晚期PBC患者(129.7±51.3pg/mlvs87.8±23.9pg/ml， p＜0.01)，而TGF-β水平顯著低于晚期PBC患者(5384.0±4055.8pg/mlvs14182.8±10894.6pg/ml;p=0.02);由于TNF-α、IL-12為M1型巨噬細(xì)胞特異性細(xì)胞因子，而TGF-β、IL-10為M2型巨噬細(xì)胞特異性細(xì)胞

12、因子，進(jìn)一步證實(shí)PBC不同階段的M1/M2分型情況。此外，本部分使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了不同階段PBC患者與健康對(duì)照者外周血單核巨噬細(xì)胞群中TAM膜受體(mTAM)表達(dá)水平，在早期PBC患者中mMer水平顯著低于晚期PBC患者(p＜0.01)，而對(duì)于其它兩個(gè)膜受體mTyro-3、mAx1在早晚期PBC患者中未見(jiàn)明顯差異;基于不同階段PBC患者中M1與M2型巨噬細(xì)胞比例以及TAM膜受體表達(dá)水平，我們進(jìn)一步分析了M2/M1比值與mMer、mTy

13、ro-3、mAx1的相關(guān)性;結(jié)果顯示mMer與M2/M1比值呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(r=0.57，p＜0.01)，即M2巨噬細(xì)胞比例隨著mMer表達(dá)升高而增加;此外，我們對(duì)M2/M1比值與PBC患者的臨床特征進(jìn)行了相關(guān)性分析，分析結(jié)果顯示:M2/M1比值與DBIL、AKP水平呈現(xiàn)正相關(guān)性(r=081，p＜0.01; r=0.71，p＜0.01)，即PBC患者血清中DBIL、AKP水平隨著外周血M2/M1比值的升高而增加;本部分研究證實(shí)PBC患者

14、外周血中巨噬細(xì)胞極化情況與mMer水平密切相關(guān)。
　　第四部分 初步探討Mer對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用及其潛在生物學(xué)機(jī)制;
　　本部分研究中，我們初步探討了TAM受體在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中的生物學(xué)機(jī)制;使用siRNA-Mer下調(diào)M0型巨噬細(xì)胞Mer表達(dá)后共培養(yǎng)凋亡膽管上皮細(xì)胞與M0型巨噬細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞比例:在未加入siRNA-Mer組中，CD163+/CX3CR1+細(xì)胞比例顯著高于加入siRNA-Mer

15、，從而可知Mer表達(dá)水平可以有效促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞方向極化;除了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞表型，為了進(jìn)一步說(shuō)明Mer受體對(duì)M2巨噬細(xì)胞極化的影響，同時(shí)檢測(cè)了M2型巨噬細(xì)胞特異性基因包括CD206、CCL18、RANTES、MDC的表達(dá)以及特異性細(xì)胞因子TGF-β、VEGF、IL-10、TNF-α、IL-12的表達(dá)水平;結(jié)果顯示CCL18及RANTES的表達(dá)水平在siRNA-Mer干擾后顯著降低，而M2型巨噬細(xì)胞因子TGF-β、IL-1

16、0的表達(dá)水平顯著的同樣顯著降低;隨后進(jìn)一步分析siRNA-Mer對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化調(diào)控過(guò)程中的相關(guān)信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染不同濃度的siRNA-Mer后巨噬細(xì)胞中總Akt蛋白水平無(wú)明顯改變，而磷酸化Akt蛋白水平顯著降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性;隨后使用Akt激動(dòng)劑SC79模擬p-Akt功能后檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中M2型巨噬細(xì)胞比例，結(jié)果顯示Akt激動(dòng)劑SC79可以有效的中和siRNA-Mer對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化的抑制作用;結(jié)合上述M2型巨

17、噬細(xì)胞表型、M2型特異性基因與細(xì)胞因子的水平變化，我們認(rèn)為Mer主要通過(guò)影響下游信號(hào)通路Akt的磷酸化水平(p-Akt)，進(jìn)而調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化;此外，siRNA-Mer可以降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10、IL-13的表達(dá)水平，而同時(shí)加入SC79后細(xì)胞上清上IL-10、IL-13水平顯著升高;綜合以上研究結(jié)果，本部分研究認(rèn)為Mer受體能夠促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，而其潛在的生物學(xué)機(jī)制是Mer受體通過(guò)調(diào)控p-Akt信號(hào)通路進(jìn)而影響M2型巨