原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血T細胞microRNA表達譜及其調(diào)控機制的研究.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)是一種以肝小葉匯管區(qū)淋巴細胞浸潤、小膽管特異性破壞、血清特征性抗線粒體抗體(AMA)為特征的自身免疫性肝病,常伴有其它系統(tǒng)、器官的自身免疫癥狀,發(fā)病機理尚不明確。越來越多的研究表明遺傳和環(huán)境因素可能在PBC的發(fā)病中具有重要作用。分子模擬和外源化學物質(zhì)可能參與PBC的發(fā)病,研究表明PBC患者的T細胞與一些來自細菌成分的肽發(fā)生反應。盡管大量的研究證實自身反應性T

2、細胞參與PBC的發(fā)病,但具體的分子機制還有待進一步研究。 微小RNA(microRNA,miRNA)為一類長度約為22個核苷酸(nt)、內(nèi)源性的非編碼RNA分子。它存在于動物、植物、真菌等多細胞真核生物中,進化上高度保守。MiRNA可通過調(diào)節(jié)mRNA半衰期(降解作用)或通過與3'UTR區(qū)的結(jié)合抑制靶基因翻譯,從而對基因表達、細胞分化、生長發(fā)育等進行精細調(diào)控。研究顯示在一些疾病中某些特定的Myma與疾病的發(fā)生發(fā)展和預后密切相關(guān),m

3、arina表達譜可以作為疾病的診斷和預后的指標。以往的研究較多集中在腫瘤。新近有研究發(fā)現(xiàn)細菌脂多糖(LPS)和病毒雙鏈RNA均能誘導表達miR-155;而miR-155敲除小鼠抗感染能力低、肺組織發(fā)生變化帶有疤痕,與人類自身免疫病病情相似；進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-155能負調(diào)控c-Maf,一個對T細胞功能特別重要的基因。因此,miRNA可能在T細胞功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用。但其具體作用機制尚待研究?；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀,我們提出了一些疑問:PB

4、C患者外周血T細胞上miRNA表達是否有其特異性的改變?異常表達的miRNA對自身免疫反應的調(diào)節(jié)機制又是什么?miRNA對PBC病變的作用是什么,是促進還是抑制?miRNA作用的靶基因是什么,靶位點又是在哪里? 為了解決這些疑問,本文進行了以下四部分研究： 第一部分 PBC患者外周血T細胞microRNA表達譜的研究 微小RNA(microRNA,miRNA)是一類重要的非編碼調(diào)控RNA,參與了哺乳動物細胞許多種

5、生物學過程。有關(guān)microRNA在疾病中的研究,尤其是miRNA的異常表達與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,引起學者們的極大關(guān)注。 本部分實驗主要目的是研究PBC患者外周血T細胞miRNA表達譜,篩選出異常表達的miRNA。采用芯片技術(shù)分析PBC患者外周血T細胞miRNA的表達；應用分層聚類分析PBC與正常對照之間的差別；用real-time PCR分析和northernblot進一步檢測某些特定miRNA的表達。 結(jié)果顯示,20個

6、正常人和20個PBC患者T細胞中miRNA表達譜并進行聚類分析,PBC患者T細胞miRNA的表達與正常對照有明顯的差別,經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),有25個miRNA在PBC和正常人中表達差異顯著,23個表達下調(diào),2個上調(diào)。其中4個miRNA(miR-346,miR-17-5p,miR-20a和miR-let-7b)顯著降低。定量PCR和northern blot結(jié)果證實了芯片結(jié)果的正確性,在20個PBC患者中,miR-346、miR-17-5p、mi

7、R-20a和miR-let-7b與正常對照比較均顯著降低,甚至比芯片中的表達區(qū)分還要明顯；miR-451和miR-129顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義。 第二部分 microRNA在PBC患者來源自身抗原PDC-E2特異性T細胞中的調(diào)控作用 自身抗原特異性T細胞的活化是T細胞介導的自身免疫病致病機理的關(guān)鍵,因此,臨床治療PBC的關(guān)鍵是抑制自身抗原特異性T細胞異常的免疫反應。這部分研究的目的是探討miRNA在自身免疫方面所起的

8、作用。培養(yǎng)來源于PBC患者PBMC的PDC-E2自身抗原特異性T細胞,轉(zhuǎn)染miRNA前體和抑制體分子,研究特定miRNA對PBC患者自身抗原特異性T細胞的調(diào)控作用,包括對細胞增殖反應及其分泌的細胞因子的影響。 結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pre-miR-let-7b,pre-miR-346,pre-miR-17-5p,pre-miR-20a細胞的增殖活性,明顯低于PBC自身抗原特異性T細胞；而轉(zhuǎn)染pre-miR-129,pre-miR-451

9、細胞的增殖活性,明顯高于抗原特異性T細胞；表明在PBC患者PDC-E2抗原特異性T細胞增殖反應中,miR-let-7b,miR-346,miR-17-5p,miR-20a起負調(diào)節(jié)作用,miR-129和miR-451起正調(diào)節(jié)作用。在細胞因子分泌方面,轉(zhuǎn)染pre-miR-let-7b、pre-miR-346、pre-miR-17-5p、pre-miR-20a的自身抗原特異性T細胞分泌的IFN-γ、TNF-α,明顯低于未轉(zhuǎn)染組和對照組,分泌的

10、IL-10與對照組無差異；而轉(zhuǎn)染pre-miR-129和pre-miR-451的自身抗原特異性T細胞分泌的IFN-γ、TNF-α明顯高于未轉(zhuǎn)染組和對照組,分泌的IL-10與對照組無差異。表明miR-let-7b、miR-346、miR-17-5p、miR-20a抑制PBC患者PDC-E2抗原特異性T細胞IFN-γ、TNF-α的分泌,miR-129,miR-451促進PBC患者自身抗原特異性T細胞IFN-γ、TNF-α的分泌。這些結(jié)果進一

11、步說明miR-let-7b、miR-346、miR-17-5p、miR-20a在PBC的免疫調(diào)控中起負調(diào)節(jié)作用,而miR-129,miR-451起正調(diào)節(jié)作用。 第三部分 miR-17-5p、miR-346在小鼠PBC樣自身免疫性病變中起負調(diào)節(jié)作用 前二部分經(jīng)體外研究證實對自身抗原特異性T細胞的免疫。本部分的目的主要是為了進一步確定miR-346,miR-17-5p在PBC疾病進展中的作用,觀察miR-346,miR-17

12、-5p對小鼠PBC樣病變的影響。本部分研究主要是在動物水平進行體內(nèi)研究,通過注,miR-346,miR-17-5p射polyI:C,在野生系雌性C57BL/6雌鼠上建立PBC模型；構(gòu)建腺病毒質(zhì)粒Ad-miR-346和Ad-miR-17-5p;在PBC模型中分別注射腺病毒pAd-miR-346和pAd-miR-17-5p,以間接免疫熒光法檢測小鼠血清中的AMA,蘇木精一伊紅(HE)法對鼠肝組織進行染色,觀察膽管周圍單個核細胞的浸潤,判斷肝

13、臟的組織學病變,以探討miR-346和miR-17-5p在PBC疾病進程中的作用。結(jié)果顯示,在注射polyI:C后的第12周,40％注射polyI:C的野生型鼠出現(xiàn)AMA,輸入pAd-miR-346+polyI:C和輸入pAd-miR-17-5p+polyI:C的小鼠只有20％出現(xiàn)AMA,PBS對照組沒有檢測到AMA。而將空載體pAd-EGFP注入小鼠后,出現(xiàn)的AMA與只注射polyI:C接近。說明miR-346和miR-17-5p在p

14、olyI:C誘導產(chǎn)生AMA的過程中起負調(diào)節(jié)作用。在注射polyI:C后的第12周,注射polyI:C、pad-miR-346+polyI:C、pAd-miR-17-5p+polyI:C,此比例分別為20％、15％和12％；而在注射polyI:C后的第24周,三組比例分別為40％、30％和25％,表明mir-346和mir-17-5p可能抑制polyI:C誘導的小鼠肝組織PBC樣病變。 第四部分 miR-17-5p、miR-346

15、靶基因的預測及驗證 認識miRNA的作用機制,關(guān)鍵是認識miRNA及其靶基因的相互作用。本文前幾部分的研究表明PBC患者抗原特異性T細胞中miR-17-5p、miR-346表達降低,且它們對抗原特異性T細胞的自身免疫反應具有負調(diào)節(jié)作用,miR-17-5p、miR-346可以延緩小鼠PBC樣病變。那么miR-17-5p、miR-346是否是通過與靶基因的相互作用參與PBC發(fā)病?他們可能作用的靶基因是哪些?其具體作用位點在哪里?基于

16、這些疑問,本文進行以下實驗：1)通過生物信息學預測miRNA可能存在的靶基因；2)通過構(gòu)建熒光素酶報告載體,經(jīng)體外細胞實驗證實miRNA作用的靶基因。結(jié)果顯示： 1)TNFRSF21和TNFSF11可能是miR-17-5p的兩個候選靶基因,BCL6可能是miR-346的靶基因。進一步分析其相互作用位點,預測出miR-17-5p可能作用于TNFRSF213'UTR區(qū)的335-342及852-858位點,miR-346可能作用于BC

17、L63'UTR區(qū)的576-583及893-900位點。 2)PBC患者T細胞及抗原特異性T細胞中BCL6 mRNA表達明顯升高,而TNFRSF21與正常對照無顯著性差異。PBC患者原代T細胞和抗原特異性T細胞中BCL6和TNFRSF21表達顯著升高。以上結(jié)果表明TNFRSF21、BCL6很可能是miRNA作用的靶基因。我們還發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miRNA與其相應靶基因重組質(zhì)粒的細胞熒光素酶表達相對較低,與對照組比較,具有顯著性差異。表明m